使用jouRNAl对人视网膜手术标本进行转录组学分析

本实验的总体目标是从人视网膜手术标本中纯化RNA，用于视网膜脱离的转录组分析。为此，需在实验室中预先准备好手术标本采集所需的试剂和材料，并运送至医院。在手术过程中采集标本后，将其送回实验室。

随后采用标准化的氯化铯梯度法纯化RNA，并对纯化后RNA的质量进行评估。最终，mRNA表达分析显示，视网膜脱离过程中涉及炎症反应和感光细胞变性，这由关键基因表达水平的变化所指示。通过转录组学分析鉴定的这些过程中，该方法相较于现有的ORNAs提取纯化方法（如GTIN氯提取法，也称为ole）的主要优势在于，所获得的ORNAs不会被DNA污染。

该技术的应用可拓展至视网膜脱离的治疗，因为它为开发新型辅助疗法提供了技术手段。每采集一个样本，使用无RNA酶的移液枪向一个五毫升无菌聚乙烯圆底管中加入2.4毫升六摩尔无RNA酶的盐酸胍溶液。用氩气填充试管上部空间。

然后迅速盖上盖子并用力压紧，确保密封。这可以防止氯化金在手术柜中储存多年后发生氧化。接下来，将每支五毫升试管放入一个50毫升无菌聚丙烯锥底管中。

加入组织并拧紧管盖后，将50毫升离心管放入聚苯乙烯架中。然后将该架子连同准备好的信封及填妥的运输单据一起放入医院内的纸板箱中。将纸板箱从手术柜运送至手术室。

手术过程中，将视网膜样本放入装有定量氯化物溶液的离心管中。 tightly 封闭离心管。短暂混匀离心管。

然后将试管置于血液试管摇床上，持续10分钟。填写随附的样本表，包括患者识别信息、手术日期以及任何其他备注。随后将识别编号写在对应的编号为50毫升的试管上。

然后将装有手术标本的5 mL离心管放入50 mL离心管中。更换纸巾并盖紧管盖。接着将50 mL离心管及样本接收表放入相应的加厚信封中并密封。

样本收到后，在实验室中将标本置于其五毫升离心管中，使用聚顿TM匀浆器在最高档位匀浆一分钟，同时上下移动离心管。匀浆完成后，为提取多糖，加入270微升2摩尔的醋酸钾溶液，并将离心管水平放置于摇床上。剧烈振荡10分钟，然后在20摄氏度下以6,500 G离心10分钟。

离心后，使用移液器小心吸取上清液，避免扰动沉淀。将上清液转移至一个14毫升无RNA酶的无菌管中。在上清液中加入5.3毫升1%十二烷基肌氨酸钠（Laurel Sarcosine）溶液（溶于100毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷缓冲液）和3.2克氯化铯。

肌氨酸可溶解膜，氯化铯用于形成梯度。将试管涡旋混匀1分钟。向一个无菌的11毫升聚合物离心管中加入1.8毫升氯化铯-EDTA溶液。

然后使用10毫升无菌巴斯德吸管，将RNA溶液沿离心管内壁缓缓加入氯化铯-EDTA溶液上层。将离心管放入离心机中。如有需要，使用另一支含有缓冲液但不含视网膜组织的离心管作为配平管，于20°C、225,000 ×g条件下离心24小时。

第二天。离心后，管子顶部会形成一层脂质层，DNA 位于中间，而 RNA 则沉淀在管底。

使用无菌巴斯德移液管，用另一支无菌巴斯德移液管小心地移除并弃去上层脂质层。逐渐移去溶液，直至黏稠的DNA被吸入。弃去溶液和DNA。

然后使用第三支无菌巴斯德移液管，移除并弃去剩余溶液，注意不要扰动RNA沉淀。现在使用火焰灭菌的手术刀，按图示方式切割离心管，并弃去上半部分。

将剩余部分倒置放在无菌纱布上。倒转离心管，用移液器吸取160 µL氯化胍溶液轻轻冲洗。让沉淀在室温下干燥10分钟。

待沉淀物干燥后，加入150微升Tris、EDTA、SDS溶液重悬。随后加入150微升Tris、EDTA和30微升3摩尔的醋酸钠，涡旋混匀以沉淀RNA。再加入900微升预冷的100%乙醇。

将试管涡旋振荡，并置于融冰上30分钟。然后在4°C条件下以18,000 G离心30分钟。离心后，可能观察到微小的白色沉淀，也可能不可见。

无论是否可见沉淀，均需小心吸除上清液并弃去。随后为去除过量盐分，加入500 µL室温70%乙醇，涡旋混匀，将离心管于4°C、18,000 ×g条件下离心20分钟。重复一次70%乙醇洗涤及离心步骤后，使用P200移液器吸除残留的乙醇。

将沉淀在空气中干燥10分钟。用50 µL去离子水重悬沉淀，涡旋振荡2分钟使其充分混匀。然后将样品置于45 °C水浴中孵育15分钟。

充分重悬RNA。最后通过在260纳米处测定吸光度确定RNA浓度，并根据方案通过凝胶电泳分析RNA。在随附的文件中，为研究视网膜脱离的转录组，采用本期刊的实验步骤，从18例视网膜脱离患者和18例年龄匹配的对照者（使用死后视网膜制备）中提取并分析视网膜RNA。

随后通过凝胶电泳和rettino碱基对RNA进行纯化和分析，本报告中所示为代表单核细胞趋化因子MCP-1基因CCL2表达情况的雷达图。图中右侧标注为RD的部分对应于视网膜脱离患者的RNA，而左侧标注为N的部分则来自对照组，如图所示。与左侧对照组相比，右侧大多数RD样本中较高的C值表明，视网膜脱离导致CCL2上调。

这种升高表明，如图所示，视网膜脱离患者存在炎症反应。视杆光感受器转导基因 GNAT1 的表达下降，与 CCL2 的变化相反；右侧 RD 样本中该基因表达值较低。同时观察到短波视锥视蛋白 OPN1SW 以及同源框基因 CRX 的表达下降，提示视网膜脱离患者的视杆细胞和视锥细胞均出现光感受器变性。该方法可为视网膜脱离后基因表达变化提供深入见解，也可应用于动物模型中的其他视网膜病变研究，例如遗传性视网膜变性。

刚接触该方法的人员可能会遇到困难，因为该方法需要掌握核酸相关知识。由于RNA在认证后操作较为复杂，因此对该方法进行直观的演示至关重要。