用于局部组织病理学分析的视网膜植入假眼处理技术

本实验的总体目标是改进对视网膜假体安全性的评估。首先，使用组织染料对标记已摘除并经最佳固定的眼球表面，以标示植入电极的位置。第二步，移除电极阵列，并将眼球组织切割成条状进行解剖。

接下来，将组织条带在琼脂中稳定，然后包埋于石蜡中。最后一步中，将标记出的目标区域进行切片，并收集到载玻片上用于染色。最终，可通过明场显微镜和免疫荧光显微镜评估每个电极邻近植入区域的组织健康状况。

该技术的主要优势在于，可在大样本中最大限度地减少固定相关的人工假象和分层现象，同时能够精确定位电极邻近的组织区域。该方法还可用于评估针对其他眼病的新植入物的安全性。通常，刚接触该方法的研究人员会发现操作具有挑战性，因为视网膜容易发生分层，且样本处理需要极高的操作灵巧性。

该方法的可视化演示非常重要，因为标记和处理脆弱组织难以掌握。在此研究之前，植入脉络膜上电极阵列后，眼球曾采用一种非最优技术进行处理，如图中星号所示。第一张图像显示了穿过电极阵列腔的一个代表性正交切面。

请注意，视网膜已从外层眼组织脱离。这一点在植入区域下方尤为明显，如箭头所示。同时请注意，无法确定视网膜的哪一部分曾与阵列中的每个单独电极相邻。

在更高倍数的放大下，视网膜各层中存在多个由常规固定释放引起的伪影，如箭头所示，同时可见与猫眼反射层（torpedo层）发生明显脱离。进一步放大后可观察到，光感受器的外节以及色素上皮层仍然保持完整，提示此前观察到的脱离现象或人为假象更可能是组织处理过程中的固定相关副产物，而非活体内的创伤或病理所致。因此，以下技术被采用以最大程度减少这些与固定相关的伪影及分层现象。

在成核并固定后，从乙醇中取出植入的眼球，小心地去除多余的组织，包括结膜和肌腱囊。将视神经修剪至2到3毫米的长度。电极阵列可通过半透明的巩膜观察到。

然后使用细头画笔小心地将组织学染料涂抹到组织上，按照预设的颜色编码标记电极，注意避免染料晕染。可进行额外的染色标记，以定义感兴趣区域或帮助切片对齐。

此处，最大程度激活的电极已用绿色标记。其他激活的电极已用红色标记。直径较大的回路电极被染成黄色，任何额外的导引结构或解剖标记均用蓝色染料标记。

空气干燥5分钟后，将眼球放回70%乙醇中以脱去染料。随后，如前所示修剪未植入的对照眼眼球上多余的组织，利用在去核和固定步骤中附着的八根尼龙缝线，将对照眼与植入眼以镜像配对的方式对齐。然后，将一个与电极阵列尺寸相同的硅胶模板放置在对照眼I上与植入眼阵列位置相对应的镜像位置。

然后按照刚刚演示的方法标记对照眼球，使每个植入电极位点在解剖位置上均有一个相应的对照配对。接着，将植入阵列从眼球中取出，随后移除眼球前部结构，包括角膜、虹膜和晶状体。接下来，清除剩余眼杯中的玻璃体液。

现在将植入的眼球组织切成多个厚度为2毫米的条状片段，每个片段包含部分带有染料标记的区域。应选择条状片段的取向，以利于评估组织对植入物反应的各个方面，并仔细记录样本上染料标记的位置，以供后续参考。

接下来，将切片条待首先切割的一侧朝下放入浅层液态琼脂中。待琼脂凝固后，沿样本周围进行切割，并将其放入由泡沫垫片支撑的组织包埋盒中。解剖并包埋对照眼后，将包埋盒置于中性缓冲甲醛中，通过标准的自动化12小时石蜡包埋程序过夜处理。

第二天，将处理好的组织包埋于石蜡中，使待切面朝下。随后，将石蜡块切成5 µm的切片。然后将各染色区域的切片转移至载玻片上。

为了准确定位DY区域，需定期在显微镜下检查切片。巩膜染色斑点紧邻的区域即为与阵列中相应电极距离最近的区域。最后，按需对切片进行染色。

高动态范围。在使用 Davidson 固定液固定后、移除阵列前，显示了带有原位脉络膜上腔电极阵列的摘除猫眼的宏观照片。半透明的巩膜使得能够观察到阵列中的各个电极。

如箭头所示，电极采用预定义的染料颜色方案进行标记。这些染料标记相对于解剖学标志点以规则间距放置，用于确保不同实验之间的一致性。移除电极阵列后，通过手工将眼球解剖成样本条带。

箭头指示了巩膜上两个电极邻近位点。虚线表示本代表性切片的切面位置，该切片来自对前一张图样品的切割，样品条的大体形状得以保留，且组织学人工假象极少。两个染料标记在巩膜上仍清晰可见，如箭头所示。

尽管绿色染料比红色染料更稳定，但染料的位置指示了电极所在处。因此，可以评估邻近视网膜组织是否因电刺激而造成损伤；在此放大倍数下可见，前一张图像中绿色染料附近的视网膜层次并未实际发生脱离，此处的视网膜形态得以保留。本图第一张图像展示了按照本实验方案处理的视网膜组织切片的代表性特殊染色及免疫组织化学结果。

血红素将细胞核染成蓝色，而伊红将细胞质、胶原和结缔组织染成不同程度的粉红色。在此图像中，吕氏快速蓝将髓鞘染成蓝色。紫晶复染剂用于通过染色位于周边蓝色区域内的神经节细胞的尼氏体，并突出周围的卫星细胞，从而识别神经节细胞。在此经马松三色蓝处理的切片中，猩红酸复红溶液将肌纤维染成红色，而亮蓝将胶原染成蓝色。

本例中，该部分经高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff）染色后，基底膜的糖蛋白成分和结缔组织成分呈紫色，而苏木精复染的细胞核呈蓝色。本图像所示的巩膜下区域在出血部位经普鲁士蓝（Pearl's Prussian blue）处理。红细胞降解后形成含铁血黄素，并释放铁复合物，产生紫色反应。

在本图像中，中性红的加入使溶酶体呈现红色，谷氨酰胺合成酶被染色。这种存在于穆勒细胞中的神经递质降解酶以绿色显示，其结构向两个方向延伸：穆勒细胞胞体位于内核层，而穆勒细胞终足则形成内界膜。该神经丝蛋白为一种重链细胞骨架蛋白，在细胞胞体及突起中呈绿色标记，神经丝蛋白与其他神经丝交联，以维持神经元的结构。

在视网膜的神经节细胞层和神经纤维层中可以观察到神经节细胞及其轴突，而位于猫视网膜内核层外缘的水平细胞轴突则呈绿色。在该最终图像中，胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）作为一种细胞骨架蛋白以红色显示，其在胶质增生过程中于Müller细胞和星形胶质细胞中表达增加，并可见沿神经纤维层分布，Müller细胞形成细长的突起贯穿内层至外层视网膜。使用蓝色DPI进行复染，有助于清晰显示视网膜各层结构。

在进行该操作时，重要的是要始终以三维视角构想样本的工作流程，并在操作过程中定期确认样本的方向。完成该操作后，可采用所有组织学方法，以在后续研究中回答更多与安全性相关的问题。该技术为仿生眼研发领域的研究人员评估盲人患者长期安全刺激参数奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何评估仿生眼植入物的安全性。