通过遗传操作调控小鼠发育期下丘脑 在子宫内 电穿孔

本实验的总体目标是将质粒DNA转染到子宫内发育的小鼠胚胎下丘脑中，以激活或抑制目的基因的功能。该过程首先对怀孕小鼠进行麻醉，并通过剖腹手术暴露子宫。第二步是将DNA溶液注射到胚胎脑的第三脑室中。

接下来，将正极电极置于子宫内胎盘与胚胎头部之间，负极电极放置于子宫外表面，并施加电脉冲。最后一步是在六天后取出转染的胚胎脑组织。

最终，通过荧光显微镜分析转染细胞的表型改变，包括细胞数量、形态、位置、标志物表达等。该技术相较于现有方法（如病毒转染）的主要优势在于：第一，无需特殊防护措施；第二，可实现对特定区域的靶向操作；第三，利用子宫内电穿孔技术，候选基因的筛选速度更快。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为将DNA溶液注入第三脑室并正确放置针电极需要较高的手动技巧以及一定的操作经验。该方法有助于回答下丘脑发育领域中的诸多问题，特别是与细胞迁移以及不同脑区和核团如何在遗传上被特化相关的问题。开始实验前，应先制备一些高质量的玻璃微量移液管，这对于减少因羊水流失导致的早期高流产率至关重要。

为制备DNA，将纯化的无内毒素血浆DNA溶解于含有0.1%快绿的磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为每微升1至2微克。快绿可使注射液在胚胎脑室中可见。接着，将10微升DNA溶液吸入玻璃微量移液管中。

然后将玻璃微量移液管连接至注射系统或口吸移液装置。在此步骤中，准备好带有加热垫的手术台和手术器械，并打开冷光源以方便观察胚胎。随后使用玻璃珠灭菌器对手术工具进行消毒。

接下来，使用异氟烷麻醉一只怀孕的小鼠。小鼠麻醉后，涂抹眼膏以防止角膜干燥。随后在其面部佩戴面罩，以持续维持麻醉状态。

现在将小鼠腹部朝上放置于加热垫上，用胶带固定其四肢以固定身体。通过轻捏小鼠尾巴检查其是否完全麻醉，确认无回缩反射。

然后剃除腹部表面的毛发，并用碘溶液进行消毒。在腹部皮肤上做一个长约1至1.5厘米的纵向切口。随后，切开腹膜。

接下来，将纱布围绕切口放置。用 PBS 冲洗纱布。用钝头镊子小心地拉出一侧子宫角使其暴露。

避免用力牵拉子宫肌层或子宫。因为子宫内压力过高会增加注射时胚胎液流失的风险，从而导致流产。然后将子宫角置于经 PBS 冲洗过的纱布上，并每隔几分钟用 PBS 冲洗一次，以保持其湿润。

现在，在显微镜下以适当方式固定子宫，以便观察脑室。不要过度调整位置不利的胚胎，以免增加流产风险。

从顶部观察胚胎的头部，找到左右皮层半球之间的裂隙位置。这两个半球易于分辨，其内部的侧脑室通常可被识别为颜色稍深的结构。若发现胚胎的方向完全适合进行DNA注射，则可直接刺穿子宫壁并立即进入第三脑室。

将预先准备好的含DNA的玻璃微量移液管以45度角对准子宫壁，在大脑半球间裂的头端处穿刺，穿透深度约为1毫米。通过这种方式，玻璃微量移液管的尖端将进入脑部第三脑室，而非侧脑室。随后向第三脑室注射约1微升DNA溶液；若注射成功，可见绿色液体充满脑室。对同一子宫角内的所有胚胎重复此操作。

这将使DNA溶液有足够时间与脑室液充分混合，并扩散至整个神经上皮。现在打开电穿孔仪，根据胚胎发育时期调整参数设置。使用不锈钢针状电极作为正极，圆形平板电极作为负极，选择背侧朝上的胚胎进行电穿孔。

然后将针电极的尖端向下刺入胚胎头部附近、羊膜囊与胎盘之间的子宫壁。接着用另一只手的食指作为支撑点。电极尖端约有5毫米应位于中脑水平的羊膜囊与子宫壁之间。

由于这是靶向电极，其位置将决定下丘脑神经上皮的哪个部分最有可能被转染。接下来，用另一只手将圆形平板电极放置在子宫壁外侧、胚胎头部的对侧。然后轻轻挤压电极之间的胚胎。

使用脚踏开关施加电压。随后，用另一只手的食指固定住子宫，同时缓慢地将针电极从子宫中抽出。如果羊水通过穿刺孔流失，胚胎通常会发生流产。

所有胚胎注射和电穿孔完成后，非常小心地将子宫放回小鼠腹腔，并将其恢复至操作前的原始位置。然后用生理盐水润湿腹膜腔，再进行关闭。使用外科肠线缝合腹膜，再用更坚固的缝线缝合皮肤。

用碘溶液消毒腹部表面，并皮下注射非甾体抗炎药以缓解疼痛。随后，将母鼠从麻醉机中取出，放入由加热垫加热的笼子中。监测小鼠直至其完全从麻醉中恢复，并每天检查，确保其术后恢复良好，无感染或疼痛迹象。

在此步骤中，根据所需的分析时间点收集胚胎或出生后样本。挑选出已注射 DNA 并进行电穿孔的胚胎，在体视显微镜下解剖其脑组织，然后在相应区域检测绿色荧光信号。

为了分析所选胚胎的脑组织，先用4%多聚甲醛对组织进行短时间固定。接着将其包埋于4%琼脂或明胶白蛋白中。然后在振动切片机上对脑组织进行切片。

这些图像显示了在 E 12.5 时期通过宫内转染携带荧光报告基因（GFP 或 CFP）的质粒 DNA 后的下丘脑。这是一张矢状切面图，显示下丘脑从头侧到尾侧的转染情况，而此处的横切面则展示了沿内侧-外侧轴不同水平的标记细胞。该矢状切面显示了特异性转染的乳头体及其特征性的轴突树突结构，而此横切面的对侧则显示出一条标记带，对应于在 E 12.5 时期出生的神经元。

为了更仔细地分析切片，制备了与从乳头体隐窝发出的放射状胶质细胞突起平面平行的水平切片。通过使用抗GFP抗体，在E18.5日鉴定出于E12.5日转染神经上皮后由其产生的ambi O神经元。

在此示例中，抗体标记了一群特定的 MBO 细胞。这群细胞位于两个未标记的外侧和内侧 MBO 区域之间，分别对应于在 E12.5 之前和之后出生的 MBO 神经元，并且通过与巢蛋白（nestin）抗体的共染色得以显示。红色显示了单个标记神经元沿神经上皮放射状胶质细胞突起迁移的方式。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 30 分钟内完成。

观看本视频后，您应充分了解如何将 DNA 注射至第三脑室，以及如何将针头作为正极放置于胚胎、头部与胎盘之间，从而高效靶向下丘脑。完成该操作后，可进一步采用免疫组织化学或原位杂交等方法，以探究转染神经元表型的更多问题。