一种用于开发定量溶胶-凝胶蛋白微阵列的引导式材料筛选方法

本实验的总体目标是鉴定基于新型凝胶材料的微阵列制备方法，并利用这些材料进行纳升级酶学检测。首先，需筛选出具有足够长凝胶化时间的材料，以避免在微阵列打印针头中过早凝胶化。第二步是评估具有较长凝胶化时间的材料在微阵列打印中的可重复性、抗开裂性、黏附质量、是否发生不良相分离，以及对包埋酶是否能维持高活性。

接下来，使用最优材料将目标酶以微阵列形式打印，并检测其在检测溶液上覆盖点样并产生可测量酶学反应的能力。最后一步是评估这些材料在利用目标酶进行高重复性检测方面的性能，并生成定量数据。最终选定用于微阵列制备的材料。

最终，利用灵魂凝胶衍生的蛋白质微阵列来鉴定能够降低酶活性的小分子。与基于孔板的筛选等现有方法相比，该方法的主要优势在于，可以使用少量试剂快速、系统地筛选大量材料。通常，刚接触该技术的研究人员会遇到困难，因为材料有可能在打印针头内部发生凝胶化。

如果这些物质未被彻底清洗干净，则会导致出现空白区域，这些区域可能被误认为是非可打印材料。首先，按照随附文本方案中所述制备多种添加剂溶液。许多溶液可预先配制，并在适当条件下保存一个月或更长时间，但有些溶液必须在实验当天配制。

使用前立即混合基于硅酸钠的锯料，并确保将其置于冰上。加入水后必须在一小时内使用SOS，因为等待时间过长会导致凝固时间缩短且不一致。接下来，按照随附文本方案中的指示，制备各种缓冲液、硅烷聚合物和有机链的组合，以确定哪些组合可作为可打印材料使用，且其凝固时间大于2.5小时。

在确定若干组合后，将打印室内的湿度设定为80%至90%。若湿度低于80%，由于打印机的沉积体积较小，可能导致样品蒸发及打印不一致。准备就绪后，使用Chip Writer Pro程序安排待打印的阵列图案。将XY方向的移动速度设为10毫米/秒，Z方向的样品接近速度设为2毫米/秒，并采用先前确定的锯齿凝胶组合，样品加载时间为2.5秒。

通过预筛过程确定相应的聚合物、有机硅烷和小分子添加剂，制备25微升的基础材料。将pH为8.0的50毫摩尔缓冲液加入384孔微孔板的各个孔中。然后在双蒸水中对直径为100微米的四槽套管针进行超声处理。

15分钟后，在氮气流下进行测试。接下来，使用通条清除针 holder 内残留的水分，并小心地将针放入接触式点样机器人打印头中。若未清除残留水分，可能导致针在 holder 内无法自由移动，从而造成点样遗漏。

打印前立即向孔中加入25 µL相应的SA。使用移液器上下吹打混合溶液，若用移液器混合，需重复50次。尽量减少混入溶液中的空气量。

气泡会阻碍样品在点样针内的完全加载。接下来，将点样针浸入样品中以完成加载。点样针加载完成后，开始打印程序，将样品打印至一张载玻片表面。

在向下一个源板添加盐之前，暂停打印过程。当过程暂停后，使用磁铁取下打印针，并在打印头中放置一根通管清洁刷，以防止打印头内积聚湿气。然后用双蒸水冲洗打印针，并在洁净的双蒸水中超声处理30秒。

接下来，在氮气流下将打印针干燥，然后将其放回打印头中。继续对源板中剩余的所有样品进行混合、打印和清洗，最多可在单张载玻片上沉积12,000个点，每个点直径为100微米。打印完成后，在打印舱内以80%至90%的湿度使芯片老化，时间至少30分钟，最长可达24小时。

使用384孔微孔板，在一个孔中将25微升1毫摩尔乙酰胆碱碘化物、0.14微升5毫摩尔BODIPY FL-半胱氨酸以及含4%甘油、pH 7.0的25毫摩尔Tris溶液混合，临用前配制总体积为50微升的阳性对照溶液。缓慢吹打混匀，避免产生气泡。接下来，临用前在另一孔中将0.14微升5毫摩尔BOAI PI FIL-半胱氨酸加入49.86微升含4%甘油、pH 7.0的25毫摩尔Tris溶液中，配制阴性对照溶液，并轻轻混匀。使用与前一节所述相同的方法，将对照样品点样到老化后的微阵列上。但此处不使用直径100微米的针头，而改用直径为235微米的槽型针头。

这可确保溶液完全覆盖先前点样的斑点。由于乙酰胆碱的自水解作用，需在室温下将芯片置于80%至90%湿度环境中老化一小时。更长的孵育时间可能导致酶活性增强，从而产生假阳性结果。

确保 alpha innotech novo 阵列成像仪已开启，并配备用于乙酰胆碱酯酶微阵列检测的激发波长为 478 ± 17 纳米、发射波长为 538 ± 21 纳米的滤光片。然后将载玻片放入载物架中，点样面朝上。设置预览区域数量，使显微镜载玻片两侧至少各有一个区域被预览，使用自动曝光模式，分辨率不低于 4 微米。

当参数被确认为可接受后，获取载玻片图像并将其保存为 TIFF 文件。接着，在 ImageJ 64 中打开获取的载玻片图像。点击椭圆选择工具，并逐一选择每个斑点。

选择一个略大于观察到的斑点的区域，并确保各斑点之间使用一致的大小，以减少 Image J 的主观性。然后使用“测量”选项在“分析”选项卡下测量每个斑点的信号强度。取 25 个相似的阳性对照斑点的强度平均值，并除以 25 个相似的阴性对照斑点的强度平均值，以获得各材料组分的阳性对照与阴性对照比值。

此处展示的是采用这些方法制备的微阵列结果的动态范围示例。高浓度对照组产生了明亮的绿色区域，而低浓度对照组则产生明显更暗的斑点。通过 ImageJ 64 测量的荧光强度显示，高浓度对照组平均约为 22,000 相对荧光单位，低浓度对照组平均接近 8,000。

虚线表示与平均值相差三个标准差的范围。以下是用于荣誉阵列筛选两种合成类似物——被鉴定为化合物一和化合物二的阿梅拉西尔生物碱——的微阵列示例。两个坐标轴均表示通过荧光信号测定的酶活性百分比。

重复实验中，散点与对角线的接近程度反映了检测方法的高度可重复性。此处展示了两种不同潜在抑制剂的IC50曲线。化合物一的IC50值为16 µM，而化合物二的IC50值为21 µM。上方显示了代表性斑点，用以说明信号强度随抑制剂浓度变化的比例关系。

此处所示的芯片上印有四种不同的激酶：P38 MAP激酶、EGFR和GSK，并分别用仅含缓冲液、含ATP的缓冲液以及含ATP和星形孢素（一种酶活性抑制剂）的缓冲液进行重叠孵育。结果表明，根据此处所述的荧光强度变化，激酶抑制剂星形孢素产生了显著效应。在本实验所用的星形孢素浓度下，P38点样的信号差异最为明显。

此处展示了 P 30 8:00 AM BP 芯片上具有代表性的点样位点，这些位点使用不同浓度的 stor sporin 进行了过量点样。如图所示，该分子的 IC 50 确定为 1 µM，并在右侧的图表中显示。一旦掌握，若操作得当，采用本方案可在数小时内完成该技术。

其他方法，如免疫测定或蛋白质相互作用测定，也可用于回答与诊断或小分子发现相关的其他问题。