DNA 微阵列：样品质量控制、芯片杂交与扫描

本实验的总体目标是使用自动化混样装置进行微阵列实验。首先在RNA扩增和标记后，利用生物分析仪分析RNA样品的质量，然后将RNA样品杂交至微阵列上。

最后，对杂交后的微阵列进行洗涤并扫描。最终通过双色荧光微阵列图像分析，获得显示RNA转录本差异表达的结果。由于该实验涉及专用设备，微阵列杂交步骤难以掌握，因此本方法的可视化演示至关重要。

质量控制分析首先按照书面规程准备2,100生物分析仪和芯片预处理工作站。然后，使用RNA 6,000 nano试剂盒中提供的离心柱，将550微升凝胶基质通过移液加入旋转滤器中。在室温下以1,500 RCF离心10分钟。

然后将过滤后的凝胶分装成每份65 µL，可在4 °C下保存长达一个月。将染料浓缩液涡旋震荡10秒，取1 µL加入一份65 µL的凝胶中。将混合物充分涡旋后，于室温下以13,000 ×g离心10分钟，所得滤胶即可用于上样。

首先将芯片放置在上样工作站上。本演示中使用的是 RNA 6,000 nano 芯片。在黑色背景上标有白色 G 的加样孔中加入 9 µL 凝胶染料混合物。

将移液管吸头置于孔板最底部。将注射器活塞定位在1毫升处，并关闭引液站。缓慢而稳定地按压活塞，直至其被卡扣固定。

30 秒后，松开夹子，让推杆上升几秒钟。待推杆停止后，将推杆拉回至 1 毫升位置，打开预灌注站。加入 9 µL 的凝胶染料。

在两个孔中分别混匀。取五微升标记物加入到加样孔以及12个样品孔中。接着，将一微升变性的DNA标准品加入加样孔，每个变性样品各取一微升加入相应的样品孔中。

最后，向每个未使用的样本中加入一微升的标记物。上样完成后，以 2,400 转/分钟的速度涡旋震荡芯片一分钟。启动 2,100 expert 软件后，将芯片放入仪器指定位置并关闭盖子。

确保选择正确的端口，并在加样后五分钟内运行检测，以防止蒸发。RNA扩增和标记的操作方法详见书面实验方案。标记完成后，纯化cRNA以去除未掺入的核苷酸；使用Cogens的简易小柱，可用NanoDrop 2000分光光度计对标记后的cRNA进行定量。

在微阵列检测模式下，记录样品浓度、得率和比活性。进行微阵列杂交前，至少需要提前两小时达到最低825纳克的得率和每微克至少8皮摩尔的比活性。打开杂交仪，并将其温度设置为65摄氏度。

本方案描述了使用安捷伦四乘40 4K芯片与罗氏NimbleGen杂交系统以及四个混合室的操作流程。在按照书面方案完成cRNA片段化后，准备杂交室。将微阵列芯片放入装配/拆卸工具中，条形码面向上。首先打开一个A4混合室，暴露固定芯片的粘合层，并使用装配/拆卸工具以防止任何移动。

将A四通道混样器从远端开始放置在载玻片上。确保其与工具正确对齐，并沿阵列粘附混样器。从混样器末端滑动，取下载玻片与混样器组件。

使用压边工具，沿粘合垫圈的整个边缘按压，以确保其与载玻片紧密粘合。粘合剂与载玻片之间被困住的小气泡在深色背景下可见。请额外花时间用压边工具将这些气泡去除。

芯片现在已准备就绪，可以加样。使用正向置换移液器加入100 µL杂交样品。将吸头紧紧插入加样孔内，缓慢而平稳地 dispensing，以避免在芯片区域滞留气泡。

当样本覆盖整个阵列且液体开始从通气孔快速流出时，立即移开移液器，但不要释放活塞。待吸头离开载玻片后，轻轻吸取两个孔处的多余液体，注意不要将样本从反应腔内吸出。然后使用镊子将贴纸覆盖在孔口上。

将玻片放入杂交仪，检查气囊孔是否准确对准O型环。这将确保杂交过程中充分混匀。关闭玻片盖和仪器盖。

将仪器设置为混合模式B，在65摄氏度下杂交芯片17小时。杂交完成后，用洗涤缓冲液一填充标记为A的玻璃皿，该玻璃皿应足够大，能够容纳组装/拆卸工具，并留有操作空间。所有洗涤步骤均应使用玻璃器皿，因为塑料器皿容易析出化合物，导致芯片背景信号升高。

将一个载玻片架和一根搅拌子放入标记为B的染色缸中，加入洗涤缓冲液至浸没载玻片架，然后将染色缸置于室温下的搅拌器上。同时，将一根搅拌子放入另一个标记为C的空染色缸中，并将其放置在搅拌器上。

从杂交仪中取出芯片，放入装配拆卸工具中。用一只手从两侧分别握住装配拆卸工具和载玻片，将整个组件浸入a皿中。小心剥离A四通道混合器，注意不要划伤芯片区域。

迅速将玻片放入染色架和染色缸 B 中。由于 SCI five 染料对臭氧敏感，应尽量减少暴露在空气中的时间。在中等速度搅拌下用擦除液洗涤一分钟。用预热的洗涤缓冲液二填充染色缸 C。

将载玻片转移并洗涤一分钟。洗涤后，非常缓慢地将染色架从染色缸 C 中取出，以尽量减少载玻片上残留的液滴。通过离心旋转两分钟使载玻片干燥。

然后将载玻片放入一个50毫升的锥形管中，并立即使用Molecular Devices公司的GenePix 4,000B扫描仪进行氩气扫描，以避免信号损失。以下是自人脑组织中分离出的四个RNA样本示例。使用Agilent 2,100生物分析仪配合RNA 6,000芯片对肿瘤组织样本的质量进行评估。

实心箭头和空心箭头分别指示18S和28S rRNA物种的位置。RNA完整性数（RIN）是RNA质量的定量度量指标，高质量的总RNA样品在生物分析仪上进行质量控制检测时，应仅产生两个主要峰，分别对应于两种主要的核糖体RNA物种。

一些RNA降解会在第一个核糖体RNA峰之前表现为拖尾弥散，而严重降解的28S rRNA峰则显著降低。低质量的RNA会在低保留时间处呈现宽峰或一系列峰，而两个核糖体RNA峰的强度会非常低，甚至无法识别。

高质量的芯片应能在相对较低的PMT值下产生高信号。在实验样本和参照样本中，大多数转录本的表达水平应相近。基因表达发生大范围显著变化的情况可能缺乏生物学意义。

因此，芯片的大部分区域应呈现黄色，而非绿色或红色。高质量的信号应处于动态范围内，使得信号直方图完全重叠，这可在芯片图像的散点图中观察到。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用自动化杂交仪进行微阵列实验。