通过星形胶质细胞转运体电流的反卷积分析推导谷氨酸清除的时间过程

本实验的总体目标是估算谷氨酸从兴奋性突触释放后，从星形胶质细胞膜上被清除的时间过程。该过程的第一步是在急性脑切片中记录突触激活的谷氨酸转运事件，分别在无和有亚饱和浓度广谱谷氨酸转运体拮抗剂TBOA的条件下进行。第二步是分析记录结果，将突触激活的谷氨酸转运体电流从诱发电反应的所有其他组分中分离出来。

接下来，通过分析在TBOA存在下记录的转运体电流，并将对照条件下记录的转运事件对滤波器的影响进行反卷积，从而估算滤波器的时间过程。由此获得谷氨酸从星形胶质细胞膜清除的时间过程。结果表明，在小鼠海马中，星形胶质细胞仅需几毫秒即可将突触释放的谷氨酸从细胞外空间基底中清除。

该方法为检测生理和病理条件下不同脑区星形胶质细胞摄取能力的变化提供了一种灵敏的工具。与其他方法相比，该方法的主要优势在于能够以高时间分辨率直接实验性地读取星形胶质细胞对谷氨酸的清除情况；例如，其他方法可能基于快速解离型谷氨酸受体拮抗剂在荧光谷氨酸指示剂上的置换分析，或基于扩散-反应的计算机模拟。该方法使我们能够理解脑内突触传递的空间和时间动态特性。

这有助于我们解读谷氨酸、扩散和摄取在某些神经系统疾病（如阿尔茨海默病）中可能发生的病理生理变化。首先用解剖刀在解剖好的小鼠脑组织上做五个切口。第一步，去除嗅球和额叶皮层。

第二步，移除小脑。接着，移除左侧和右侧颞叶。然后通过正中矢状切口分离两侧大脑半球。

接下来，将每个脑切片的侧面粘附到冰冷的振动切片机底板上。脑组织的背侧应朝向振动切片机的刀片，而腹侧则与远离振动刀片的琼脂块接触。然后将振动切片机底板固定到解剖室中。

将切片厚度设置为250微米，并在切片前调整刀片宽度。当刀片通过皮层和海马后，使用解剖刀将皮层海马从中脑分离。随后，将切片置于浸没式孵育室中，在34摄氏度下孵育30分钟后再将切片保持在34摄氏度环境中。

在用于本实验步骤的电生理记录之前，让样本冷却至室温30分钟，然后将一片样本转移至记录室。在点光源照明或红外差分干涉（I-R-D-I-C）下观察样本。星形胶质细胞可通过其较小的细胞体和明显的细胞核来识别，以进行突触刺激。

将一个双极不锈钢电极放置在拟进行膜片钳记录的星形胶质细胞附近约100微米处。对星形胶质细胞进行膜片钳记录，并通过施加极轻微的负压吸力进入全细胞记录模式。随后每隔10至20秒交替给予单刺激和成对刺激，以分离出突触激活转运过程中被增强的部分。

首先，在对照条件下以及在存在 10 微摩尔广谱谷氨酸转运体拮抗剂 TBOA 的情况下，对至少 20 次双脉冲刺激所获得的记录进行平均；然后，在对照条件及 10 微摩尔 TBOA 存在下，对相同数量的单脉冲刺激所获得的记录进行平均。将双脉冲刺激所得的平均迹线减去单脉冲刺激所得的平均迹线。此步骤可分离出由第二次刺激诱发的 STO 几何信号及持续性钾电流。

下一步，在时间间隔等于用于传递成对脉冲的 PUL 间隔的情况下，用单次刺激获得的平均迹线减去经过时间偏移的单次刺激平均反应，再从先前获得的第二次刺激的平均反应中扣除该结果。此步骤可分离出由第二次刺激诱发的转运体电流中的易化部分。在大多数情况下，此步骤可完全消除持续性的钾电流。

如果确实如此，则FSTC的分离已经完成，可以继续进行解卷积分析，从而获得星形胶质细胞谷氨酸清除的时间过程。然而，在某些情况下，仍可能存在微小的持续性钾电流，需要进一步分析。测量执行操作后残留的持续性钾电流的幅度。

先前所述的分析通过将测得的持续性钾电流的幅度设为该方程中的参数 a，从而将单指数函数的幅度与残余持续性钾电流的幅度进行标定。但上升时间常数代表了在分别独立的实验中，对分离出的持续性钾电流所估算的上升时间的平均值。在药理学上，使用高饱和浓度的 TBOA，然后将得到的单指数函数从 FSTC 和持续性钾电流中减去。

完成FSTC的分离。分离光激活转运事件。在对照条件下以及含10微摩尔TBOA的条件下，分别获取至少20次光路开放时的扫描信号并取平均值；同样，在对照条件下以及含10微摩尔TBOA的条件下，分别获取相同数量光路关闭时的扫描信号并取平均值；然后，用光路开放时的平均信号减去光路遮蔽时的平均信号。

此步骤可去除刺激伪迹，并分离出FTC。在此步骤中，将控制条件下和10 µM TBOA条件下记录的FSTC或FTC进行多指数函数拟合，创建一个瞬时上升、单指数衰减的函数，该函数最能描述在10 µM TBOA条件下记录的转运电流衰减相。接下来，从10 µM TBOA条件下记录的转运电流拟合结果中反卷积出该单指数函数，以获得滤波器。然后，将该滤波器从控制条件下转运电流的拟合结果中反卷积，从而分离出目标信号。

为了定量估算谷氨酸清除的整体时间进程，应在尝试该操作时计算波形的积分光密度（OID）。重要的是要确认转运事件是在滤波器处于线性工作状态且仅对转运产生线性失真的实验条件下记录的。可通过检查改变转运电流大小的操作来验证这些电流波形是否符合要求。

请勿更改其标记进程。观看本视频后，您应能充分理解如何利用星形胶质细胞记录来提取有关脑内谷氨酸扩散与摄取的信息。