肽-金属配合物结构与配位测定的1D与2D ¹H NMR方法

本实验的总体目标是确定与铜结合的金属伴侣蛋白模拟肽复合物的结构。首先在无氧环境中制备样品，以完成这一目标。第二步是获取核磁共振（NMR）波谱数据，以显示氢原子之间的相互作用。

接下来，将空间相互作用映射到线性肽模板上。最后一步是找到一个符合实验数据的代表性低能结构。最终，利用核磁共振（NMR）解析的结构来确定结合模式，并对铜结合复合物进行结构分析。

与X射线晶体学等现有技术相比，该技术的主要优势在于可用于研究弱结合复合物，以及无法结晶的分子和复合物。尽管该方法可用于研究铜结合蛋白，但也可应用于其他体系，例如其他金属伴侣蛋白，以研究蛋白质如何在细胞系环境中实现必需但潜在有毒金属离子的安全递送。

首先，在无氧环境中制备样品，以防止铜发生氧化。制备APO样品时，将约一至两毫克的多肽溶解于450至500微升的氘代核磁共振级溶剂中。对于铜反应样品，将相同量的多肽与等摩尔量的金属盐一同溶解于450至500微升的核磁共振溶剂中。使用中心玻璃滤纸或任何适用于待研究化合物且不会吸附样品的过滤技术对每种溶液进行过滤。此步骤至关重要，可去除任何金属颗粒，从而避免影响样品的均一性。

将溶液转移至核磁管中，并在手套箱内将样品密封。离开手套箱前，将样品取出并再次密封。使用核磁共振仪记录APO样品与铜反应后样品的一维质子谱图，并进行比较。

APO 肽具有柔性，表现出多种构象的平均状态，但在与铜反应后，结合铜的肽酰胺结构变得更加刚性。因此，含铜肽的核磁共振谱在酰胺区域应显示出明显的化学位移变化，且峰形可能变得更加清晰。按照文本方案中所述的相同条件，设置优化的 cosy、tox、nosy 或 rosy 核磁共振实验，并依次运行。

每次实验之间运行一维实验，以确保在整个数据采集过程中样品组成保持恒定。按照文本方案中讨论的方法处理数据后，准备一组与 noea 和 rosy 谱图叠加的 cozy 谱图。用于指认谱图中的所有 NOE 峰。

首先对指纹区中与毒素信号重叠的峰进行归属。这将有助于后续使用Sparky程序进行峰归属，并记录已归属的峰，将Hα与酰胺质子的耦合值转换为二面角。同时，在程序内对峰进行积分，并结合已知距离的相互作用关系，将峰信号转换为距离约束条件。

如果峰发生重叠或无法使用自动积分方法，则可通过目视估计将峰标记为强、中、弱或很弱，并可将这些标记分别转换为不超过 2.5、3.5、4.5 和 5.5 埃的距离约束。在导入距离约束和二面角时需使用正确的格式以供 Explore 使用。Explore 将搜索构象空间，以找到符合标准化学几何结构的构象。

除了实验确定的距离约束外，还需生成一个不违反这些参数的系综，该系综将作为起始系综。在首次结构测定运行中，不使用任何金属约束，以无偏倚地确定参与金属结合的残基。

逐步引入约束条件，以便在使用共轭梯度能量最小化方法进行 4,000 次迭代优化结构之前，识别出化学位移指认中的错误以及 NOE 能量和模拟退火参数（如文本方案所述）。随后，通过在整个结构集合上以迭代方式逐步引入约束，最终生成通常包含 50 个成员的结构集合，并报告所发现的每种类型 NOE 相互作用的数量。最后，生成一组符合标准化学几何构型及经验性核磁共振（NMR）衍生约束条件的结构集合。报告总构象数、其中违反 NMR 衍生约束条件的构象数量，以及整个集合的均方根偏差（RMSD），包括主链和所有重原子的 RMSD 值。

分析低能量构象集合，确定哪些残基侧链相互处于正确的接近位置，能够结合金属离子。确定这些残基后，结合铜结合数据重复分析。除了核磁共振（NMR）获得的距离约束外，现在还需将金属结合约束添加到已确定的残基上。

添加适当的参数以描述金属离子及其拓扑结构。将相应的物理信息（如与其他原子的质量、键长、键角以及非键合排斥参数）输入到参数文件中。将结合信息添加到拓扑文件中。

该信息包括在结合过程中形成的键和断裂的键，以及由此改变的正式电荷。最后，获取一组结构，因为已解析的集合代表了肽所采用的构象空间。在进行核磁共振（NMR）测量期间，将结构的所有构象导入 Mal Mall 程序以创建初始集合。

通过分析系综来确定分子的局部稳定性。沿序列选择连续的四个残基区域，计算主链和侧链的均方根偏差（RMSD）值，并让程序以能量最低的结构或平均结构为参考计算RMSD；通过绘制局部RMSD随序列位置变化的曲线，确定分子中具有局部稳定性的区域；沿该区域叠加系综结构，并以此系综进行后续分析。选择符合核磁共振（NMR）衍生约束条件的低能量构象。

这些将构成低能构象集合的记录，并报告集合中构象的数量、选择标准以及 RMSD 值。如果金属结合模式尚未确定，则需分析低能构象集合，判断哪些残基侧链的取向不正确，以及它们是否彼此靠近，足以结合金属离子。

使用 KYMERA 确定疑似金属结合原子之间的分子内距离。在确定这些距离后，计算系综中的平均距离。重复分析，纳入铜结合数据。

使用 MAL mall 程序的默认搜索参数分析该集合，并确定分子内的局部二级结构。接着，将该集合导入 kymera。二级结构由氢键维持，代表分子中的稳定区域。

使用 Kymera 工具确定氢键结合情况。继续按照文本方案中详述的方法进行结构分析。然后汇总所有结构研究结果，揭示它们如何相互支持。为了研究铜结合蛋白模型，通过溶液态核磁共振（NMR）确定了衍生线性肽段中蛋白保守结合序列的结构，检测范围为肽段的酰胺区 6.7 至 8.5。

PP M 与铜反应后扩展至 6.6 至 9.0 PP M。基线中可明显观察到由于轻微铜氧化引起的谱线展宽。图中显示的是 Roy Toxi 和 cozy 谱中铜结合肽指纹区的叠加图。样品随时间保持稳定，谱图分辨率良好，并通过 rosy 实验获得了 81 个 NOE 相互作用。

由于该分子在NOESY实验中几乎未产生NOE相互作用，因此对反应样品推导出的构象集合在未施加金属约束的情况下，50个结构中有47个非合理结构，主链和重原子的RMSD值分别为1.44和2.07埃。从中选取了13个低能量构象进行进一步分析，其主链和重原子的RMSD值分别为0.25和0.61埃。局部RMSD图谱显示，在第3至第7位残基之间存在一个稳定区域。除了刚性的C末端区域（包含一个脯氨酸残基）外，该区域在所有构象中均表现为第4至第7位残基之间的弯折构型。

该弯折结构通过甘氨酸5和丙氨酸2的主链供体与受体之间的氢键作用得以稳定，同时也涉及半胱氨酸6与半胱氨酸3之间的氢键。该弯折在半胱氨酸3和丝氨酸7区域也较为明显，表现为该区域的耦合值降低。在将这些构象在此区域进行叠加后，以半胱氨酸3、半胱氨酸6和甲硫氨酸1作为潜在结合残基，对可能的结合残基进行了分析。

最短的硫原子与硫原子之间的距离存在于半胱氨酸三和半胱氨酸六的叶酸基团之间，引入铜结合后，重新进行计算以获得用于分析的构象集合。铜结合肽的低能构象集合显示，末端胺基靠近结合的铜离子。此处展示的是静电势分布的等势面，其中正电势以蓝色表示，负电势以红色表示。

精氨酸残基从肽链主链延伸出来，形成一个带正电的静电势区域，而主链碳原子的排列呈线性，形成一个较不明显的负静电势区域。一旦掌握该方法，可在约一周的核磁共振实验时间以及随后几天的数据处理时间内完成结构测定，从而获得一组可用于结构分析的构象集合。通过该实验流程，还可分析其他肽突变体及不同条件，以探究铜离子在不同结合与释放程度下所需的具体条件。