离子淌度-质谱技术用于研究金属结合寡肽的金属离子识别结构与氧化还原活性机制

离子淌度-质谱联用技术（IM-MS）可鉴定肽类分子在pH依赖性氧化还原反应及甲基结合反应中生成的各种产物离子。结合其三级结构的分子模拟，可确定金属相关性。IM-MS能够分辨每种产物离子，并通过同时测定其质荷比和到达时间，关联其化学计量比、质子化状态及构象结构，从而鉴定其分子组成。

开发金属螯合肽的类别将有助于治疗与金属离子失衡相关的疾病，例如门克斯病和威尔逊病、癌症以及阿尔茨海默病。首先，用约500微升的0.1摩尔冰醋酸、0.1摩尔氢氧化铵，最后用去离子水彻底清洗ESI进样管和针尖毛细管。根据文本方案中所述的天然ESI-IM-MS条件，分别采集10 ppm聚-DL-丙氨酸溶液的负离子和正离子IM-MS谱图，每种模式采集10分钟。

用移液器将200.0微升0.125毫摩尔的替代性甲烷单胞菌素（amb）溶液加入1.7毫升样品瓶中。加入500微升去离子水稀释，并充分混匀溶液。通过加入50微升1.0摩尔的乙酸溶液，将样品的pH值调节至3.0。

向pH值已调节的样品中加入200.0微升0.125毫摩尔的金属离子溶液。然后加入去离子水，使样品最终体积达到1.00毫升。充分混匀，并在室温下静置平衡10分钟。

使用钝头注射器取 500 微升样品，分别采集负离子和正离子电喷雾电离离子淌度质谱（ESI-IM-MS）谱图，每种模式各采集五分钟。使用剩余的 500 微升样品，通过校准的微型 pH 电极测定其最终 pH 值。重复上述步骤，通过加入不同体积的乙酸或氢氧化铵溶液，将样品 pH 分别调节至 4、5、6、7、8、9 或 10。

分别采集所得溶液的负离子和正离子电喷雾电离-离子淌度-质谱（ESI-IM-MS）谱图，每种各10分钟。通过将离子淌度-质谱（IM-MS）谱图中的信号与其理论质荷比同位素分布模式进行比对，确定其中存在的替代型甲烷单加氧菌素（methanobactin）的带电物种。为此，打开MassLynx软件，点击“Chromatogram”以打开色谱窗口。

转到“文件”菜单，选择“打开”以定位并打开离子迁移-质谱（IM-MS）数据文件。通过右键点击、在色谱图上拖动并释放，提取IM-MS谱图。谱图窗口将打开，显示IM-MS谱图。

在谱图窗口中，点击“工具”和“同位素模型”。在同位素建模窗口中，输入 amb 物种的分子式，勾选“显示带电离子”框，并输入电荷态。点击“确定”。重复此过程以鉴定 IM-MS 谱图中的所有物种，并记录它们的质荷比同位素范围。

针对每种amb物种，利用其质荷比同位素图谱识别并分离任何偶然重叠的质荷比物种，并提取它们的到达时间分布（ATDs）。打开DriftScope软件，点击文件（File）并选择打开（Open），定位并打开离子迁移谱-质谱（IM-MS）数据文件。使用鼠标左键单击以放大amb物种的质荷比同位素图谱。

使用选择工具并单击鼠标左键来选中同位素峰型。单击“接受当前选择”按钮。为分离任何偶然重叠的质荷比物种，使用选择工具并单击鼠标左键，选择与 amb 物种同位素峰型相对应的到达时间分布（ATD）时间。

单击“接受当前选择”按钮。要导出ATD，请转到“文件”菜单，选择“导出至MassLynx”。然后选择保留漂移时间，并将文件保存到相应文件夹中。

在 MassLynx 的色谱图窗口中，打开已保存的导出文件。从菜单中点击 Process（处理），选择 Integrate（积分），勾选 ApexTrack Peak Integration（ApexTrack 峰积分）选项框，然后点击 OK（确定）。记录 ATD 的质心位置和积分面积。对所有保存的 amb 以及 poly-DL-丙氨酸 IM-MS 数据文件重复此操作后，使用在每个滴定点提取的 amb 物种（正离子或负离子）的 ATD 积分值，归一化为相对百分比尺度。

为此，将每种 amb 物种在不同 pH 条件下的身份信息及其积分 ATD 值输入电子表格中。针对每个 pH 值，使用积分 ATD 的总和将各个 amb 物种的 ATD 标准化为百分比形式。绘制每种 amb 物种的百分比强度随 pH 变化的关系图，以显示各物种群体组成随 pH 的变化情况。

使用电子表格，将聚-DL-丙氨酸阴离子和阳离子在氦气缓冲气体中测得的碰撞截面转换为校正后的碰撞截面。然后，将聚-DL-丙氨酸校准物和amb物种的平均到达时间转换为漂移时间。绘制聚-DL-丙氨酸校准物的漂移时间与其校正后碰撞截面的关系图。

然后，使用最小二乘回归拟合，确定 A' 和 B 值，其中 A' 用于校正温度、压力和电场参数，B 用于补偿离子淌度（IM）装置的非线性效应。结合这些 A' 和 B 值以及质心漂移时间值，计算其校正后的碰撞截面以及碰撞截面。该方法可为肽类物质提供碰撞截面，其估计的绝对误差约为 2%。使用 Gaussian 软件配合 GaussView，采用 B3LYP/LanL2DZ 理论水平，对所有可能的观测到的质荷比（m/z）配合物物种的配位构型进行几何优化，寻找其稳定构象。

B3LYP LanL2DZ 理论水平由 Becke 三参数杂化泛函、Dunning 基组和电子核势组成。从 Gaussian 输出文件中提取每个优化构象体的热化学分析数据，并使用 Sigma 程序中的离子缩放 Lennard-Jones 方法计算其理论碰撞截面。从自由能最低的构象体中，确定哪一个构象体的 Lennard-Jones 碰撞截面与离子迁移率-质谱（IM-MS）测得的碰撞截面相符。

该过程可确定实验中观察到的构象体的三级结构及其配位类型。分子建模需要比较具有不同金属螯合位点、顺式和反式肽键、盐桥、氢键以及π-阳离子相互作用的构象体的自由能和碰撞截面。对另一种甲烷氧化菌素one的离子迁移率-质谱（IM-MS）研究表明，它能以pH依赖的方式螯合铜离子和锌离子，但其反应机制和配位位点不同。

在 pH 大于六的条件下，观察到锌(II)的结合，主要形成单一的带负电荷的复合物，表明锌(II)由两个咪唑基团和两个硫醇盐以四面体方式配位。铜(II)的结合伴随着巯基形成二硫键桥。当 pH 大于六时，形成单一的带负电荷的铜(II)复合物，表明铜(II)由咪唑基团和两个去质子化的酰胺氮原子配位。然而，在 pH 低于六时，加入铜(II)不仅形成了单一的带正电荷的铜(I)复合物，还形成了在 pH 高于六时出现的单一带正电荷的铜(II)复合物。

对amb two和amb four的离子迁移率-质谱（IM-MS）研究还表明，铜反应产物在分子内或分子间二硫键的数量、铜(I)或铜(II)离子的数量以及去质子化位点的数量上均存在差异，且这些差异随pH值的变化而改变。结合分子模拟的IM-MS结果显示，替代型甲烷单加氧菌素可通过硫醇盐、咪唑和羧酸盐基团配位多达三个铜(I)离子。如文中所述，必须谨慎选择IM-MS仪器参数，以保持肽的化学计量比、电荷分布和构象结构。

结合更广泛尺寸范围的影响因素（如天冬氨酸位点的酪氨酸）对金属配位的作用，将有助于更深入理解结构与功能之间的关系。离子迁移率-质谱（IM-MS）与分子模拟已成为加速解析蛋白质、DNA、脂质及其复合物构象结构的替代技术，可作为晶体学和核磁共振波谱学的补充。