一种通过电化学发光免疫分析法测定血清心脏肌球蛋白结合蛋白-C的高灵敏度和高特异性定量方法

本实验的总体目标是同时定量血清样本中的心肌肌球蛋白结合蛋白 C 和心肌肌钙蛋白 I。首先，使用心肌肌球蛋白结合蛋白 C 抗体包被 96 孔板以进行单重检测，或采用预编码的三重检测实现该目标。第二步中，将包被后的酶标板与校准品和血清样本共同孵育。

最后一步加入标记的检测抗体，产生化学发光信号，由酶标仪检测。最终，可通过单重或多重免疫测定法确定血清样本中心脏蛋白的含量。实验前一天，将30微升不含明胶的小鼠单克隆抗心肌肌球蛋白结合蛋白C抗体用移液器加入96孔微尺度发现裸标准板每个孔的底部角落。

然后轻敲平板边缘，使抗体溶液均匀覆盖每个孔的底部。密封后，在4°C下静置孵育过夜，不摇动。次日早晨，将溶液在水槽上方倒出，随后倾倒于一叠纸巾上。

然后每孔加入150微升含1% blocker A的PBS溶液，以阻断非特异性结合。将板密封后在室温下孵育1小时，阻断过程中以700 RPM速度振荡。同时，在含1% blocker A的PBS溶液中，将重组心肌肌球蛋白结合蛋白C片段稀释至起始浓度为2000纳克/毫升。随后将该溶液按5倍比进行连续稀释，共制备七种不同浓度的标准品。

现在按照刚刚演示的方法移除封闭液，然后用 150 微升含 0.05% Tween 20 的 PBS 溶液洗涤 3 次。第三次洗涤后，用力将酶标板在水槽上方快速振荡甩干，随后将酶标板在纸巾上用力轻拍，直至完全干燥。接下来，用移液器向相应的孔中加入 25 微升的标准品和样品。

然后，在密封的酶标板于室温下在摇床上孵育一小时的同时，将自制的、用磺基罗丹明标记的心肌肌球蛋白结合蛋白C检测抗体用含1%阻断剂A的PBS稀释至1微克/毫升。按照前述方法仔细洗涤酶标板后，向每孔加入25微升检测抗体溶液，随后将密封的酶标板在室温下振荡孵育一小时；在孵育期间，运行带有LED灯的示例板，以确保sector成像仪及软件功能正常，同时稀释Reid缓冲液。按照前述方法再次仔细洗涤酶标板后，使用多通道移液器向每孔加入150微升Reid缓冲液，注意避免产生气泡，然后立即在sector成像仪中扫描酶标板，再开始进行三重检测实验。

将96孔三重检测板和稀释液在室温下平衡。然后向板中加入25微升含1% blocker A的PBS溶液，确保溶液完全覆盖每个孔，并将密封的板在室温下振荡孵育30分钟。在此期间，将重组心肌肌球蛋白结合蛋白C、CK-MB和心肌肌钙蛋白I共同用含1% blocker A的PBS稀释，配制标准品，其中包含2000纳克/毫升的心肌肌球蛋白结合蛋白C、100纳克/毫升的CK-MB和25纳克/毫升的心肌肌钙蛋白I。

然后将此混合物进行五倍系列稀释，每份标准品稀释后的终体积至少为100微升；将稀释后的标准品用含1%阻断剂A的PBS溶液稀释两次。接下来，取2份25微升的技术重复样，包括标准品和待测样本，加入到三重检测板各孔中已有的25微升封闭缓冲液中，并设置仅含稀释液的空白孔。将密封的酶标板在振荡条件下孵育两小时后，将三种SUL oag检测抗体共同稀释至每种抗体在含1%阻断剂A的PBS溶液中的终浓度均为1微克/毫升。按照前述方法洗涤酶标板，然后使用多通道移液器向每个孔中加入25微升检测抗体溶液。

将密封的酶标板在孵育期间以 700 RPM 振荡，孵育 1 小时。运行示范板，并按照刚刚演示的方法稀释 Reid 缓冲液。然后用含 0.05% Tween 20 的 PBS 洗涤酶标板，使用多通道移液器向每孔加入 150 µL Reid 缓冲液，避免产生气泡，并立即在 Sector 成像仪中扫描酶标板。

在此图中，对比了单重检测法与三重检测法中心肌肌球蛋白结合蛋白 C 的标准曲线。两种检测方法均表现出极高的灵敏度和宽广的动态范围。检测范围区域以灰色显示，包括单重和三重检测法。

心肌肌球蛋白结合蛋白C的标准曲线相似。在二重和三重检测中，其检测下限、定量下限和定量上限水平均具有可比性。这些图显示了三重检测板中心肌肌钙蛋白I和CKMB的标准曲线。

两种校准品均表现出高灵敏度和宽动态范围。检测区域在图中以灰色显示。通过将三种校准品各自的单个标准曲线分别与单一检测抗体孵育，研究了检测抗体与其他两种校准品的交叉反应性；结果显示，CKMB校准品与心肌肌钙蛋白I及心肌肌球蛋白结合蛋白C的检测抗体之间仅存在少量交叉反应。

尽管未观察到其他校准品与检测抗体之间存在交叉反应性，从而证明了该检测方法适用于心脏损伤的检测，但仍通过三重检测板比较了16名心肌梗死患者的血清水平与对照组。测定了心脏肌球蛋白结合蛋白C-C-K-M-B和心脏肌钙蛋白I的血清水平。与对照组相比，心肌梗死患者的这三种生物标志物水平均升高。