经验证的免疫化学检测法用于全面测定细胞释放及细胞结合的人表皮生长因子受体2

我们介绍了一种经过验证的夹心ELISA方法，该方法使用新型单克隆抗体，可对体外培养细胞及患者样本中与细胞结合及释放的HER2蛋白胞外结构域进行精确定量。

该方案旨在满足在诊断和研究中，通过准确且经过验证的检测方法将循环HER2蛋白浓度与疾病临床表现相关联的需求。

该检测方法具有较宽的检测范围、可适用多种样本类型，且结果可靠，可能为体外和体内模型中受体状态的全面分析提供新的机遇。

开发的ELISA将用于定量检测从癌组织释放到不同人体排泄物（如血液、腹膜液或黏液）中的HER2。

[Instructor] 当细胞生长至80%融合度时，使用胰蛋白酶消化并脱离细胞，收集至一个独立的15毫升锥形离心管中。使用自动细胞计数仪对细胞进行计数后，将每孔三乘以十的五次方个细胞接种于12孔板中，每孔加入1毫升培养基。将细胞培养物置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。从培养24小时后的细胞中，将每个细胞系一孔的培养基收集至1.5毫升离心管中。在4摄氏度条件下，以10,000 × g离心10分钟，然后将上清液转移至新的离心管中，并于-20摄氏度保存。用1毫升预冷的PBS洗涤各孔中剩余的细胞，轻柔吸弃PBS并弃去。随后，向每孔加入200微升RIPA裂解缓冲液（含1%蛋白酶抑制剂），冰上孵育5分钟。使用细胞刮刀刮下细胞，并通过反复吹打使裂解液充分混匀均质。将裂解后的细胞收集至新的离心管中，缓慢吸取样品至配有21号（0.8 × 40毫米）针头的2毫升注射器中。吸取5至10次后，在4摄氏度条件下以10,000 × g离心10分钟，将上清液转移至新管中并于-20摄氏度保存。用包被缓冲液将抗HER2捕获抗体稀释至1微克/毫升。使用多通道移液器，向96孔ELISA板的每孔加入100微升捕获抗体溶液。用封板膜覆盖板孔，于4摄氏度孵育过夜。过夜孵育后，将ELISA板置于室温水平微孔板振荡器上孵育1小时。使用微孔板洗板机吸去包被液，并用PBST缓冲液每孔300微升洗涤三次。随后，使用多通道移液器向各包被孔中加入含5%脱脂奶粉的PBS封闭缓冲液100微升，以封闭非特异性结合位点。接下来，准备标准曲线和阳性对照。将2微升浓度为1毫克/毫升的HER2储备液加入1998微升PBS中，配制成1000纳克/毫升的工作标准品1。将标准品1取500微升与500微升PBS混合，充分混匀，得到浓度为50纳克/毫升的标准品2。通过系列稀释法配制标准品3至7。接着，使用PBS稀释的细胞裂解液和培养基样品，并加入已知浓度的HER2制备基质样本。将细胞裂解液按1:2000比例稀释（取2.5微升裂解液加入5毫升PBS），使HER2浓度低于检测限。为配制2纳克/毫升的溶液，取8微升标准品1加入392微升PBS、培养基或细胞裂解液中，充分混匀。使用单通道移液器，将各标准品、PBS空白及待测样本各取100微升，每样本设三个复孔，分别加入已包被并封闭的ELISA板对应孔中。在37摄氏度湿盒中孵育1小时后，使用微孔板洗板机洗涤ELISA板。为检测抗体结合情况，将生物素标记的检测抗体用PBS稀释至工作浓度1微克/毫升。使用多通道移液器向每孔加入100微升该检测抗体溶液。随后，将Avidin-HRP偶联物按1:40,000比例稀释于40毫升PBST中。使用多通道移液器向每孔加入100微升稀释后的偶联物溶液。孵育并洗涤板孔后，使用多通道移液器向每孔加入100微升3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，以启动比色反应。然后用封板膜覆盖ELISA板，于37摄氏度避光孵育1至5分钟，同时监测显色情况。当达到理想显色强度时，向每孔加入100微升终止液以终止反应。最后，使用酶标仪在450纳米波长处测定吸光度。采用四参数拟合标准曲线，根据曲线方程计算各样本的浓度。所建立的夹心ELISA法对HER2蛋白的检测线性范围为1.56至100纳克/毫升，决定系数为1，表明拟合效果极佳。在所有测试的细胞系中，培养基中的HER2浓度随时间延长而升高，在72小时达到最高值。在24小时时间点，SK-OV-3和SK-BR-3细胞的培养基中HER2浓度分别比MDA-MB-231细胞高出约10倍和50倍。同样，裂解液中SK-OV-3和SK-BR-3细胞的HER2水平分别约为MDA-MB-231细胞的3倍和5倍。值得注意的是，与全细胞裂解液中膜结合的蛋白相比，细胞培养基中该抗原的浓度低约1000倍。