光遗传靶向前脑环路的激光扫描光刺激

本实验的总体目标是将现代光遗传学技术应用于体外脑片标本中，对特定神经元通路进行光刺激。首先需在目标神经元细胞系中表达通道视紫红质 Dossin，以实现第一步。实验的第二步是制备待研究的相关脑区的急性脑片标本。

下一步是记录脑片标本中神经元在光刺激表达视蛋白的视杆Dossin纤维时的反应。最后一步是对表达视蛋白的神经元和纤维的分布进行成像。最终，该方法能够通过激光扫描光刺激光遗传靶向的神经组分，评估神经环路的功能拓扑结构和突触特性。

与传统电刺激方法相比，该技术的主要优势在于能够特异性地靶向并刺激特定的神经元细胞类型，并在体外研究其长距离投射。该方法有助于回答系统神经科学领域中的关键问题，例如复杂神经回路的功能性组织。准备一支注射器和针头用于注射病毒溶液，该溶液每毫升含有四微克聚乙烯亚胺（poly）以增强转染效率。

然后使用注射泵压力注入 200 纳升的溶液，两周至三周后，脑片中将有充足的通道视紫红质表达。在取出注射后的脑组织后，应尽快进行制备，用干净的剃须刀片按所需方向将脑组织切成块状。接着，使用速干胶将脑组织的切块面固定在切片台上。

然后将样本转移至预冷的振动切片机切片室中，并向切片室加入冰冻人工脑脊液。使用振动切片机将脑组织切成4至500微米厚的脑片。将脑片转移至充氧的孵育室中，在30摄氏度条件下孵育至少一小时，然后继续进行实验。

准备开始实验时，将脑片转移至电生理记录装置的载物台上。采用标准的全细胞膜片钳技术记录神经元。将记录电极移至神经元附近，同时对电极施加正压。

与细胞建立接触后，释放压力并施加负压以形成吉欧封接。随后施加短暂负压击破膜片，形成全细胞记录模式，并在电压钳或电流钳模式下进行记录。使用潮汐波（tidal wave）或EFAs数据采集软件操作激光扫描系统。

使用前必须将软件与光电二极管校准，以控制激光功率。在其光路中放置一个可变中性密度轮。通过测量后焦平面处的光强，旋转该轮可调节激光功率。

功率通常设置在25至D毫瓦之间。快门的脉冲参数可在软件中控制刺激的持续时间和时序。可通过抓取视频功能获取待刺激区域的图像。

接下来，设置刺激网格，例如一个 16×16 的网格，间距为 80 微米。然后将该网格叠加到获取的图像上，并调整 XY 坐标和偏移角度，以优化刺激的起始方向。启动映射功能。

数据将被保留，可使用 tidal wave 中的离线分析程序进行分析，也可使用 EFAs 软件中的 map 分析程序进行分析。在完成脑片上的生理记录后，可记录 YFP 标记的通道视紫红质的表达模式。首先，在 4°C 条件下，将脑片在含 4% PFA 的 0.01 摩尔 PBS 溶液中固定过夜。

第二天，将切片转移至含30%蔗糖和4%多聚甲醛的溶液中，4℃过夜以进行冷冻保护。次日，使用冷冻切片机将组织切成50微米厚的切片。用PBS冲洗切片，然后用抗荧光淬灭封片剂封片，并在共聚焦显微镜下成像。

在白光下找到感兴趣区域后，使用514纳米激发波长和527纳米发射波长进行成像。用于成像驱动通道棒状结构Dobson的YFPA病毒构建体，该构建体在BSY小鼠的初级视觉皮层中表达EYFP，并注射至兴奋性谷氨酸能神经元中。

在初级视觉皮层与次级视觉皮层之间的投射通路以及外侧膝状体（LGN）的皮层-丘脑纤维中均检测到病毒表达。对次级视觉皮层中标记为星号的神经元进行全细胞膜片钳记录，检测到兴奋性突触后电流（ePSCs）。在对通道视紫红质（channelrodossin）表达的纤维进行激光扫描光刺激后，观察到来自初级躯体感觉皮层第6层投射至次级视觉皮层下层的皮层-丘脑通路。通过CRE依赖的LAX方法，在第6层皮层-丘脑神经元及其投射纤维中表达通道视紫红质。正如预期，将flocked a a V载体转染至CRE转基因小鼠后，靶向的第6层神经元及其延伸至第4层的纤维均成功表达了通道视紫红质。

在通道视蛋白Dobson、EYFP表达的纤维中，也观察到投射至腹侧苍白球（VP）的纤维，该投射通过VP神经元的生理记录得以证实。采用全细胞膜片钳技术记录发现，在记录神经元附近进行光刺激后可诱发出PSCs，该被记录的神经元以星号标记。离线分析显示了腹侧苍白球中对光刺激的平均反应幅度。在表达通道视蛋白Dobson-EYFP的6层皮层丘脑神经元的50微米切片中，观察到标记纤维呈现出精细的形态，这些纤维从第6层穿行至第4层，并在该层终止并广泛分支。

此外，观察到皮质丘脑纤维进入白质并延伸至丘脑。观看本视频后，您应能够充分理解如何在离体脑片制备中应用现代光遗传学技术，以光刺激特定的神经通路。请务必注意，在执行本实验相关的校准步骤时，使用激光器可能具有极高的危险性。

佩戴护目镜。