通过激光扫描光刺激绘制抑制性神经元环路

本实验的总体目标是研究抑制性神经元环路的局部功能组织。实验首先从鼠类初级躯体感觉皮层制备活体脑切片，随后在脑切片中对表达 GFP 的特定抑制性神经元类型进行可视化观察和记录。

通过谷氨酸进行激光扫描光刺激后，利用光解技术激活小簇的突触前神经元，使其产生兴奋性或抑制性反应。在表达GFP的中间神经元中记录突触后电流。最后一步是完成光刺激、数据分析，并生成突触输入到所记录神经元的定量图谱。

最终，激光扫描光刺激结合全细胞记录技术能够构建特定类型抑制性神经元突触输入的详细图谱，从而有助于确定局部皮层抑制性环路的组织结构与功能。该光刺激技术由 Larry Katz 博士和 Ned Calloway 开创，并由 Carols Waboda 博士进一步发展。我的导师 Xing Z 博士曾在索尔克研究所（the Salk Institute）师从 Calloway 博士，主导了多项关于口周环路的研究。目前，我们课题组正在延续并拓展这些研究，深入探索口周环路的结构与功能。

开始此操作时，通过断头法处死一只出生后两周至三周的转基因小鼠，并迅速取出脑组织，将脑组织置于冰冷且充氧的切割溶液中。然后使用GFP护目镜对脑组织进行肉眼筛选，检测GFP表达情况。接着，用振动切片机将初级躯体感觉皮层切成400 µm厚的切片。

将脑片置于用95% O₂和5% CO₂混合气体饱和的含蔗糖人工脑脊液（A CSF）中，在32摄氏度下孵育30分钟至1小时。随后，将脑片转移至室温下的普通A CSF中。准备实验所需的激光系统：开启激光冷却系统和电源，启动与光刺激控制相关的所有硬件设备，包括扫描镜系统、光调制器、电子快门以及光电二极管输入放大器。

接着打开电生理设备，例如 Multi Clamp 700 B 放大器和显微操作器。电生理记录、光刺激和成像均在安装于显微镜电动载物台上的切片灌流室中进行。随后，打开成像相机，通过成像系统可在直立显微镜下利用红外微分干涉差（DIC）和落射荧光光学技术观察切片。

然后在显示器上打开基于 MATLAB 的 FS 软件和 Q Capture 相机软件。实验运行前，检查激光光刺激系统，确保其处于正常工作状态。在四倍显微镜物镜下方放置一张纸，观察系统运行时的激光扫描模式。

为了制备具有四到六兆欧电阻的微电极，使用移液管拉制仪拉制玻璃电极。然后用含有0.1%生物素的内液填充电极，用于细胞标记和形态学鉴定。接下来，打开加压灌流系统，将人工脑脊液泵入灌流腔室。

确保记录 chamber 中切片上方的液面高度恒定为 2.0 毫米。取一份 MNI 笼锁型谷氨酸原液，加入 25 毫升循环 aCSF 中，使其终浓度为 0.2 毫摩尔的笼锁型谷氨酸。随后将一片脑切片转移至记录 chamber 中。

运行成像系统以检查脑片质量，并进行解剖学定位以确定初级躯体感觉区。接着，使用自制的带弦铂金环固定脑片，注意避免将固定环置于拟记录的脑区上方。在DIC荧光显微镜下，通过GFP表达情况，利用60倍物镜观察细胞。

鉴定并选择抑制性细胞类型。请注意，记录将在红外微分干涉差（DIC）成像的视觉引导下进行。在将电极下降至目标细胞的过程中，需要通过视频监控并在DIC模式与荧光模式之间切换，以确认GFP标记细胞的位置。

采用传统的膜片钳技术。首先，对电极施加正压，将其移至细胞表面附近，使目标细胞膜上形成一个明显的凹陷。

然后迅速施加负压以形成吉欧封接，并在视频监视器上监测电流注入反应的同时穿破细胞。穿破后，在微分干涉（DIC）和荧光模式下，以60倍放大倍率拍摄记录到的表达GFP的胞内神经元图像，用于在线验证。在采集光刺激数据之前，注入超极化和去极化电流脉冲，以检测每个细胞的基本电生理特性。

当记录稳定后，通过良好的接入电阻（通常小于20兆欧）实现全细胞记录，将显微镜物镜从60倍切换至4倍放大倍数以进行激光扫描光刺激，以4倍放大倍数获取脑片图像，并用该图像引导和定位光刺激位点。通过激活Phys的配置切换模块来设定光刺激和数据采集参数。使用持续时间为1毫秒、功率约为20毫瓦、刺激间隔为1秒的激光脉冲。

进行光刺激定位时，采集采样频率为10千赫兹、持续时间为1秒的数据轨迹。接着，将四倍切片图像载入phys软件的定位模块。定义胞体位置，并设置光刺激位点为16×16阵列，每个位点间距为80微米×80微米。

围绕细胞位置的间距，覆盖所有皮层。然后通过在电流钳模式下检测记录神经元在光刺激下的放电位置，绘制其兴奋性反应图谱。我们这款用户友好的软件具备在线显示功能，可有效促进定位绘图实验的进行。

随后，通过检测记录细胞的兴奋性突触后电流，绘制局部兴奋性环路连接图。采用激光扫描在不同位置进行刺激，将细胞在电压钳模式下钳制在负70毫伏，以检测向内的兴奋性电流。然后，将光刺激模式旋转或翻转，重复获取兴奋性突触后电流图谱两到三次。为绘制局部抑制性环路连接，检测记录细胞的抑制性突触后电流。

在此情况下，将细胞钳制在接近零毫伏的水平，即电压钳模式下负15毫伏，以检测外向抑制性电流。完成所有生理检测后，轻柔地将电极从记录细胞中取出。将脑片从记录室中移出，然后在4%多聚甲醛中固定过夜，并对记录的细胞进行生物素染色。

在本实验中，通过结合GFP表达、固有电生理特性以及形态学特征，对抑制性神经元进行分类。此处展示了用于说明激光扫描光刺激的示例及原始数据图，该技术可广泛绘制局部皮层回路与记录到的抑制性神经元之间的连接图谱。以下是根据图D中刚刚展示的原始轨迹数据生成的颜色编码定量输入图的示例。在记录到的中间神经元中检测到的突触事件的幅度经过颜色编码，并在空间上叠加于光刺激的位置之上。

细胞体的位置由比例尺中的红色空心圆表示。暖色表示对目标细胞有较强的突触输入，冷色表示较弱或无连接性。同样，图E展示了记录到的神经元在每个采样解笼位置处的突触事件数量。

图 F 展示了光刺激后记录细胞首次检测到突触事件的发生时间，比例尺如图所示。暖色表示较短的输入潜伏期，冷色表示较长的突触潜伏期。因此，LSPS 能够构建出投射到特定类型抑制性神经元上的输入在位置、强度、潜伏期和数量方面的详细图谱。

进行该操作时，重要的是要有耐心，保持实验环境洁净，并且在将观察对象从高倍镜转换到低倍镜时，要小心谨慎、有效地操作神经元。最后，需熟练使用成像软件。