在果蝇睾丸中成像中心体

本实验的总体目标是利用基因标记的中心体-细胞体（Centro Somal）标记物来筛选新的基因突变，并揭示新鉴定出的中心体-细胞体基因的功能。该目标可通过三种不同的成像策略实现：途径A，活体睾丸成像；途径B，睾丸化学固定；或途径C，免疫染色。

该实验的第一步是分离表达基因标记中心体蛋白的果蝇睾丸，随后可立即进行成像。第二步是化学固定睾丸，之后也可进行成像。第三步是对睾丸进行免疫染色，然后进行成像。

最终，中心粒蛋白的位置通过荧光显微镜进行鉴定。该方法有助于回答中心区研究领域中的关键问题，例如中心体形成、中心体伸长以及中心体分离的分子基础。首先按照 JoVE 出版物 2 6 4 1 中详细描述的方法分离果蝇睾丸。

分离睾丸后，将样本浸入6 µL新配制的室温DAPPY染色缓冲液中，置于带正电荷的玻璃显微镜载玻片上。10分钟后，用6 µL PBS更换染色缓冲液两次，轻轻洗去多余的DPI。

注意不要将睾丸组织冲走。用滤纸从载玻片边缘吸去溶液。对于18平方毫米的盖玻片，使用6 µL的液体体积效果较好。

现在可以使用锋利的手术刀在目标细胞类型的附近刺破睾丸组织，以减少压片过程中对这些细胞的压力。然后小心地将盖玻片覆盖在样品上，并用指甲油密封。接着用笔在载玻片上标记睾丸的位置，随后进行成像。

分离睾丸后，将其浸入载有六微升 PBS 的液滴中，该液滴置于带正电荷的玻璃载玻片上。手动将睾丸以线性方式或其他偏好的方向排列。然后使用一片滤纸吸去 PBS，并替换为六微升 freshly prepared 固定缓冲液。

在固定缓冲液中放置5分钟后，用滤纸吸去缓冲液。随后将样本浸入6 µL新配制的DPI染色缓冲液中，染色10分钟。用两份各6 µL的PBS溶液替换染色缓冲液，以洗去DPI。

然后小心地将一块 18 平方毫米的盖玻片盖在样本上，并用指甲油封固。接着在载玻片上标记睾丸的位置，随后进行成像。进行此操作时，首先准备一些硅化处理的盖玻片。

首先，在室温下于通风橱内将盖玻片浸入盛有硅化溶液的小托盘中一分钟，确保盖玻片完全浸没且彼此不重叠堆叠。接着，用清水清洗盖玻片三次，每次清洗一分钟。随后用70%乙醇清洗三次，每次一分钟，最后再用清水清洗一次，持续一分钟。

然后将硅化盖玻片置于通风橱中自然晾干。解剖多个睾丸并标记载玻片上的样本类型后，向硅化盖玻片上加入5 µL PBS，并将睾丸转移至PBS液滴中。每个盖玻片上放置一个睾丸，需准备多个这样的盖玻片以确保实验成功。

接下来，在解剖显微镜下，参照之前的操作方法，小心地刺破每一份睾丸组织。然后，轻轻地将一块带正电荷的玻璃载玻片盖在盖玻片上，使 PBS 在盖玻片与载玻片之间均匀分布。

然后用吸水纸吸去盖玻片与载玻片之间的多余缓冲液，以增加对睾丸的压力并将其压扁。接着将制备好的载玻片放入液氮中。现在可继续制备更多载玻片并加入液氮罐中。

使用大号镊子操作前，先将一张载玻片从液氮中取出，并迅速用解剖刀去除盖玻片。去除盖玻片时，应确保样本仍保留在载玻片上。注意不要在S载玻片表面涂抹或拖动样本。

可通过使用手术刀快速一击使盖玻片断裂脱落来实现。现在将载玻片放入盛有甲醇的玻璃染色缸中，在零下20摄氏度条件下孵育15分钟。

孵育结束后，将切片转移至含有丙酮的染色缸中，在负20摄氏度下放置30秒。随后在室温下用PBS洗涤切片1分钟。

接下来，将切片置于新配制的PBST中孵育10分钟，以封闭非特异性结合位点。在PBS-TB孵育期间，向湿盒的孔中加入水。孵育10分钟后，从PBST中取出切片，并在每个切片的样本周围轻轻擦干，注意不要使样本本身干燥。每张切片擦干后，

将其放入湿盒中。在加入抗体溶液之前，必须将玻片上标本周围区域干燥。这能确保抗体保持在标本局部，从而防止孵育过程中标本干燥。

然后将 100 微升用新鲜配制的 PBSTB 缓冲液稀释的一抗溶液轻柔地滴加到样本上。对于尚未表征的抗体，使用 1:200 的稀释比例。随后，在样本上覆盖一块 1 厘米见方的帕拉膜，以均匀分散抗体溶液并防止其蒸发。

将标本在室温下孵育1小时。1小时后，用镊子轻轻将对苯二甲醛从载玻片上移除。随后在室温下用PBST洗涤载玻片三次，每次5分钟。

随后，将切片转移至湿盒中，组织面朝上，轻轻加入100微升用PBST稀释的二抗（BR）至组织上。与之前相同，加入多聚甲醛，孵育1小时，然后用PBST洗涤三次，每次5分钟，再用PBS洗涤三次，每次5分钟，以洗去未结合的二抗。然后小心吸干切片上的液体，注意不要触碰组织。

加入6 µL封片剂，盖上标准盖玻片。用指甲油密封盖玻片并标记睾丸的位置后，进行成像。在精子发生过程中，中心体经历多种形态和功能上的转变。

一个易于观察的过程是精原细胞中的中心体伸长，长轴末端（LAR）标记物 ANA 一 GFP 标记了长度为 0.6 微米的中心体；该中心体在精子发生过程中逐渐伸长，在接近成熟的精子细胞中达到 2.5 微米的长度。由于黑腹果蝇精子的中心粒异常细长，因此可通过成像对中心体的伸长过程进行定量分析。与野生型形态相比，目前已鉴定出多种影响中心体生长的突变类型。

两个典型的例子是早期突变和炮弹突变，这些突变会在减数分裂开始前阻断精子发生过程，但不会抑制这些突变体中中心粒的延长。在这些突变体中，成熟精母细胞的中心粒长度可生长至约2.4微米，而对照细胞的中心粒最大长度仅为1.8微米。一旦掌握，路径A可在20分钟内完成，路径B可在30分钟内完成，路径C则根据样本大小需要三到五小时。观看本视频后，您应能充分理解如何对飞行中的中心体进行成像。