内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的免疫荧光分析

本间接免疫荧光实验的总体目标是优化人细胞中内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白（包括着丝粒蛋白A和带flag标签的外源CENP-A蛋白）的定位与定量分析。该方法有助于解答如何鉴定和定量着丝粒-动粒蛋白的关键问题。该技术的主要优势在于，可根据所选的特定后期阶段，用于量化不同水平的着丝粒-动粒蛋白表达。

接种后18小时，用PBS洗涤培养的细胞一次，然后向6孔聚苯乙烯培养板的每孔中加入500微升低血清培养基。接着，用新鲜配制的A和B混合溶液转染每孔中的细胞，并将培养物置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。4.5小时后，更换为含胎牛血清和抗生素的高糖DMEM培养基，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养。

48至72小时后，吸除细胞培养基，用PBS洗涤细胞一次，加入生理盐水时沿培养孔壁缓慢加入，避免扰动细胞。随后在4摄氏度条件下，用4%多聚甲醛固定细胞30分钟。固定结束后，用Kb2缓冲液洗涤细胞两次，并在室温下用Kb1缓冲液对样本透化处理30分钟。

然后用 Kb2 缓冲液冲洗细胞一次，并加入新鲜的 Kb2 缓冲液以阻断非特异性结合。室温孵育五分钟后，用镊子将每个孔中接种了细胞的盖玻片取出，使用疏水屏障笔在每张盖玻片样本周围绘制疏水屏障。将盖玻片转移至新的六孔聚苯乙烯板中，并在 37 摄氏度下将其浸入相应的一抗溶液中孵育一小时。

然后用 Kb2 缓冲液将细胞冲洗三次，并在 37 摄氏度下用相应的二抗孵育一小时。孵育结束后，用 Kb2 缓冲液对样品进行五次洗涤，每次 6 分钟。随后在室温下用含有 DapE 的 Kb3 缓冲液对细胞核进行染色，持续 5 分钟，接着用 Kb2 缓冲液洗涤一到两次，并用 Kb2 缓冲液重新填充孔板。

现在，为每张细胞盖玻片取一张显微镜载玻片，并在载玻片中央滴加一滴封片介质，同时去除细胞样本上的任何液体。最后，小心地将每份样本置于已准备好的显微镜载玻片中央，并用纸巾去除多余的封片介质。如本代表性实验所示，在转染CUL4A siRNA的细胞总裂解液中，内源性CENP-A蛋白的表达水平与转染Luciferase siRNA细胞中的CENP-A表达水平相似。

此外，RBX1 siRNA 转染细胞全细胞裂解液中内源性 CENP-A 的蛋白水平与萤光素酶 siRNA 转染细胞中的内源性 CENP-A 水平相似，表明 CUL4A-RBX1 E3 连接酶对于 CENP-A 定位于着丝粒是必需的。CENP-A 赖氨酸突变体失去了在着丝粒内定位的能力，提示 CENP-A K124 位点的泛素化对于其定位于着丝粒至关重要。重要的是，外源性单泛素与 CENP-A 蛋白的融合能够挽救 CENP-A K124R 突变体的错位表型，使该蛋白重新回到着丝粒位置。

一旦掌握，若操作得当，细胞固定和免疫荧光染色步骤可在五到六小时内完成。请记住，在向孔板侧壁添加所有溶液时应轻柔操作，以免在冲洗或浸没样本时使细胞从盖玻片上脱落。切勿忘记，在通风不良的环境中使用加热的多聚甲醛，或在火源附近使用易燃材料均可能带来极大危险，因此在进行该操作时务必采取适当的防护措施。