从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

本实验的总体目标是从新生小鼠中分离皮层小胶质细胞。首先从新生小鼠中显微解剖获取皮层脑组织，然后在体外培养混合胶质细胞 17 至 21 天，以实现该目标。

接下来，从这些混合胶质细胞培养物中分离小胶质细胞。最后一步是将小胶质细胞接种到细胞培养板中，以进行后续实验。最终，通过免疫荧光显微镜和ELISA检测，证明该分离方案能够保持小胶质细胞的免疫表型及其功能特性。

该方法的可视化演示至关重要，因为显微解剖过程中涉及的 SEP 操作难度较高。成功实施该操作需要兼顾速度与准确性：操作过慢会降低细胞得率，而脑膜去除不完全则会污染胶质细胞培养物并阻碍胶质细胞生长。

首先配制小胶质细胞完全培养基（以下简称为MCM）。每只幼鼠准备一个培养瓶，并至少孵育一小时。此平衡步骤对实验成功至关重要。

接着，准备分装并置于冰上预冷。每个仔鼠需准备六毫升 MCM 培养基，分装后在解剖前放入 37 °C 水浴中预热。用 70% 乙醇擦拭水平气流工作站和解剖显微镜。

接下来，将手术所需的已灭菌外科器械放入工作区域。准备一个盛有解剖液的无菌培养皿用于获取头部，另备一个用于解剖。将剪切液分装至单独的培养皿中，用于剪切脑组织。

断头并取出脑组织后，将新鲜分离的脑置于解剖显微镜下观察脑膜，确保背侧朝上并保持干燥。用镊子尖插入中脑与皮层交界处固定脑组织。固定后，彻底去除背侧的皮层脑膜。

接下来，去除脑腹侧的软脑膜以最大限度地提高小胶质细胞的纯度和得率。必须彻底清除所有脑膜组织。将大脑皮层与其他脑组织分离。

务必去除皮层腹侧或内侧可能残留的任何皮质脑膜。去除脑膜组织后，将皮层放入先前准备好的剪切皿中。在二级生物安全柜中操作，使用剪刀剪碎脑组织。

将切碎的组织转移至一个15毫米的锥形管中。分别用一毫升的切碎液冲洗剪刀和切碎皿，以最大限度提高得率。收集冲洗液，并将其加入含有切碎组织的15毫升锥形管中。

将组织悬液静置一到两分钟，使剪碎的组织沉降到管底。静置结束后，小心移除并弃去两毫升上清液，注意不要扰动已沉降的组织碎片。向剪碎的组织中加入三毫升预热的MCM培养基，然后用力吹打组织。

取样完成后，应无明显的固体组织残留。使用同一枪头再加入三毫升 MCM，以收集枪头末端残留的消化样本。收集完毕后，离心剪碎的组织以沉淀细胞。

操作完成后，将沉淀的细胞放回生物安全柜中。小心移除并弃去上清液。轻柔地重悬。

用 2 毫升预热的 MCM 重悬细胞沉淀，然后将重悬的细胞悬液加入先前准备好的培养瓶中。将细胞培养 24 小时。24 小时后，轻轻用手掌轻敲培养瓶，以分散组织碎片。

轻敲前后均需检查细胞，确保碎片完全清除。随后，更换为新鲜的MCM培养基，并将培养瓶放回培养箱。每日检查细胞，以监测生长状况和污染情况。

大约 17 至 21 天后，小胶质细胞将准备收获；要确定细胞是否已准备好，可在倒置相差显微镜下观察。当小胶质细胞达到约 40% 的汇合度时，即为可收获状态，此时它们呈小而明亮的球形细胞，以单层形式生长于其他细胞之上。

为了分离小胶质细胞，用力将培养瓶在实验台面上轻敲。这种震荡有助于利用小胶质细胞黏附性较低的特性，使其与其他胶质细胞分离。用甲醛密封培养瓶瓶盖，并将混合胶质细胞培养物置于温度可控但无加湿的旋转摇床上旋转5小时。

此时，需肉眼观察小胶质细胞是否已从培养瓶表面脱落。在倒置相差显微镜下，小胶质细胞呈明亮的球形悬浮细胞。培养瓶底部仍会残留一层星形胶质细胞和少突胶质细胞贴壁。

随后，收集含有小胶质细胞的上清液，转移至无菌的锥形离心管中，并重悬。将小胶质细胞沉淀用预热的小胶质细胞生长培养基重新悬浮，并使用血细胞计数板测定细胞浓度。24 小时后，在 24 孔板中，将细胞接种于塑料或无菌玻璃盖玻片上。

更换为新鲜的温热 MGM 培养基，以去除悬浮细胞和碎片。此步骤对细胞存活以及维持小胶质细胞的静息状态至关重要；完成该换液步骤后，小胶质细胞即可立即用于实验，以评估小胶质细胞的纯度。来源于内源性表达 GFP 的小胶质细胞的细胞培养物，使用针对巨噬细胞抗原 IBA1 的抗体进行染色，并用 DAPI 复染。

为了观察细胞核，超过95%的细胞显示出GFP IBA1与dpi的共定位。在用LPS刺激细胞后，小胶质细胞从较小的双极形态转变为类似阿米巴样的形态。P65的免疫荧光染色结果表明，在正常条件下，P65在细胞质中呈弥散分布。

然而，在经过两小时的Pam P处理后，P65免疫反应性显著转移至细胞核内，从而证实分离得到的微胶质细胞仍保持其生物化学和免疫功能。在暴露于PAM或LPS后，检测了促炎性细胞因子TNFα的分泌情况。观看本视频后，您应能充分掌握如何从新生小鼠大脑皮层中分离微胶质细胞以获得最佳实验结果。

保持无菌操作技术并彻底清除解剖皮质区域中的脑膜组织非常重要。