从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞

本方案具有重要意义，因为我们逐渐认识到胶质细胞在不同脑区具有区域性异质性，表现为形态、功能和基因表达上的差异。该技术的主要优势在于，可从中枢神经系统的四个不同区域分离出三种独立的胶质细胞亚群进行研究。本次实验操作将由我本人及实验室的研究生 Rachel Tinky 演示。

使用精细剪刀从幼鼠头部尾侧开始，沿中线向吻端方向剪开皮肤层，直至鼻部。注意避免过深切割颅骨，以防组织损伤。将头部向下倾斜，将皮肤层向两侧拉开，使用弹簧剪刀从枕骨大孔处开始，沿颅骨中线进行切开。

用尖头镊子将颅骨两半分开，暴露大脑皮层、小脑和脑干。暴露后，轻轻将脑组织从颅腔中取出，放入含有10毫升PBS缓冲液和抗生素溶液的10厘米培养皿中。确保脑组织完整无损，且后脑部分仍与脑体相连。

用精细的弯头镊子夹取小脑，放入预置在冰上的15毫升锥形管中。将中脑与大脑皮层分离。

去除脑皮层的软脑膜并将其放入指定的锥形管中。必须仔细检查组织，以确保软脑膜被完全清除。如果培养物中残留软脑膜细胞，可能会对胶质细胞的生长产生不利影响。

解剖脊髓时，将脊髓腹侧朝上放置，使用精细弹簧剪刀交替从左右两侧剪开椎骨，直至暴露脊髓组织。轻柔地取出脊髓和脑膜，并将其放入冰上预先准备好的锥形管中。向每支含有组织的试管中加入1毫升含0.53毫摩尔EDTA的0.05%胰蛋白酶溶液。

用10毫升移液管将混合物吹打约20次。然后将细胞悬液转移至一个空的50毫升锥形管中。在37°C和5%二氧化碳条件下孵育15分钟。

孵育八分钟后轻轻振荡裂解液。孵育结束后，向每根试管中加入5毫升MGM和200微升DNase I，使终浓度达到50微克/毫升。用10毫升移液器将每份裂解液吹打10次。

然后将细胞悬液在室温下静置3分钟，使未解离的组织沉降至管底。将细胞悬液转移至新的50毫升锥形管中，留下未解离的组织。离心后，用5毫升MGM重悬细胞沉淀，并吹打20次。将细胞悬液接种至包被的T25培养瓶中，在37°C和5%二氧化碳条件下培养细胞。

24小时后更换培养基以去除细胞碎片。进行少突胶质前体细胞分离时，将细胞振荡15小时，然后从培养瓶中收集上清液并接种至无菌培养皿中。将上清液在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育30分钟。

15 分钟后轻轻混匀以去除残留的小胶质细胞。移除非贴壁细胞的上清液，计数细胞，并将其以所需浓度接种于多聚-D-赖氨酸包被的培养表面。将细胞放回培养箱中孵育至少 1 小时。

然后轻柔地吸出95%的培养基，并缓慢加入预热的OPC培养基，用移液器将培养基沿孔壁加入，以尽量减少对OPC的扰动。该方法曾用于证明干扰素γ信号通路影响OPC的分化与成熟。缺乏干扰素γ受体时，皮层OPC无法 readily 分化为成熟的可髓鞘化少突胶质细胞，这表现为MBP染色缺失。

还分析了GFAP的表达。干扰素γ缺陷的细胞强烈表达GFAP，提示这些细胞可能正在获得星形胶质细胞表型。中枢神经系统细胞的区域性异质性体现在大脑皮层、小脑、脑干和脊髓中星形胶质细胞形态的差异。

同一区域的星形胶质细胞也可能表现出形态学异质性，这支持了胶质细胞亚型具有高度动态性的观点。研究还探讨了少突胶质前体细胞（OPCs）对不同细胞因子刺激的区域性反应。细胞因子信号转导显著影响干细胞和免疫细胞的行为，并可能影响OPCs向成熟髓鞘形成少突胶质细胞的分化过程。

区域胶质细胞分离后，细胞可用于多种实验条件，并可采用免疫组织化学、定量实时PCR和蛋白质印迹等多种技术进行分析。