用于成像和免疫组织化学的视网膜全层铺片制备的优化方案

该实验利用小鼠视网膜组织，演示如何稳定脆弱的神经组织以保持其结构完整性。在免疫组织化学染色的多个步骤中，首先切除眼球，去除角膜，并将视网膜与巩膜分离。在视网膜眼杯上做切口，以展平组织。

然后使用负压转移法将视网膜附着在带支撑环的膜上，避免直接操作，以保持组织的完整性。接着将带视网膜的支撑环转移至多孔板中进行染色。我们的结果表明，该技术可有效用于活体组织，并为突触蛋白的成像提供了优于现有视网膜处理金属方法的优良基底。

这些技术可实现对精细组织的转移，同时最大限度地减少物理操作，从而降低组织变形和损伤的风险。我们最初是在需要对视网膜变性小鼠模型（RD1 小鼠）中扁平铺片的视网膜组织进行记录时产生这一想法的，该小鼠由于突变基因 Chief 导致大量细胞死亡，视网膜变得极薄且脆弱。

我们实验室的一名博士后将与我共同演示该操作步骤。首先，摘除麻醉小鼠的眼球，并将眼球转移至充氧的HEPES缓冲林格液中。为去除角膜，用镊子夹住角膜缘部位，然后沿锯齿缘环形剪开。

使用镊子取出晶状体，以便进行团注注射和电生理记录。用刃口镊子尽可能多地去除玻璃体。现在用镊子牢固地夹住巩膜，以稳定眼杯。

将第二把镊子置于视网膜与眼杯之间，缓慢沿周边移动镊子。在视网膜与眼杯之间剪断视神经，并用剪刀移除眼杯。

从视网膜周边部开始，一直切至视神经处。或者，若需使用整个视网膜，可从周边部切至视神经的一半距离，以缩短支架长度。使用车床去除多余部分。

然后用细砂纸打磨粗糙的表面。从环的下方取下支脚。剪掉塑料移液管的狭窄尖端。

然后将组织连同部分溶液转移至膜上。在铺展视网膜的同时逐渐去除溶液，并展开组织。现在将视网膜的神经节细胞面向上贴附于膜上。

剪下一毫升注射器的持握尖端，将其直接置于组织下方。将活塞向后拉动至约 0.3 毫升的体积，以物理方式将组织嵌入膜内。使用约一兆欧的电阻拉制一些硼硅酸盐毛细玻璃移液管。

然后轻轻折断每个膜片电极的尖端。接着，将0.3 µL的选择素储备染色液加入10 µL的HEPES缓冲林格溶液中。现在将膜置于灌流有温热含氧HEPES缓冲林格溶液的记录室中。

使用显微操作器将含有染料的移液管抵住内界膜。进一步推进移液管以穿透内界膜，随后将染色液注入单个或多个目标位置。

现在给予组织 10 分钟时间在落射荧光照明下恢复注射带来的影响。如有需要，将插入物转移至玻璃底培养皿中，使视网膜面朝下。添加一滴 HEAP 溶液以保持样本湿润。

此外，在塑料环的边缘周围涂抹三处真空脂，以将插入物牢固地固定在培养皿上。固定后，将培养皿转移至显微镜载物台，将膜浸入蔗糖梯度溶液中。从塑料插入环上切除膜。

用无尘纸尽可能吸除溶液，将组织置于载片上，视网膜朝上。将带有组织的载片转移至冷冻切片机腔室，并加入一滴OCT包埋剂。使用快速冷冻装置加速冷冻过程。

取下冷冻的样品并翻转。现在切去多余的冷冻OCT包埋剂，在样品的三个侧面各保留约两毫米，而在将要连接到样品托的一侧保留毫米。

用一滴OCT覆盖暴露的视网膜面，保留附着区域不覆盖。冷冻含有视网膜组织的膜。在冰冷的持环上滴加一滴OCT。

立即将冷冻样品浸入液滴中。在负19摄氏度下切取10至20微米厚的切片，并将其贴附于温热的多聚赖氨酸黏附载玻片上。将带有切片的载玻片置于41摄氏度的加热平台上，在避光条件下孵育两到三分钟。

然后将样品储存在零下20摄氏度。本实验展示了一种快速且简单的视网膜血管系统表征方法，视网膜血管系统是一个跨越多个视网膜层次的复杂血管网络。通过结合团注加载iso-selectin与亚甲蓝浸染标记，可几乎立即对活体组织进行可视化观察和扫描，从而实现从浅层到深层对视网膜血管的标记。

与相对易于扩散的SRH相比，选择素（selectin）不易穿过内界膜。在标记突触蛋白时，使用碳二亚胺（carbimide）固定相比传统的多聚甲醛固定具有多个优势；例如，经碳二亚胺短时间固定后，对突触标志物PSD-95进行免疫荧光染色，在内丛状层（IPL）中呈现出明亮的点状结构，能够清晰区分单个突触。

相比之下，使用传统的多聚甲醛固定剂时，突触组分的识别较为模糊。在视网膜冷冻切片中也获得了类似的结果。观看本视频后，您应能充分掌握如何将精细的组织样本装载到该膜上，以及如何对制备好的样品进行细胞化学染色。

将视网膜连接到滤膜上需要花费15分钟。