通过预包埋免疫电镜技术研究视网膜环路与分子定位

在我们的研究中，我们专注于视网膜生理学及其相关疾病。需要研究视网膜神经环路中的细胞组成以及特定的神经递质。总体目标是探索整个通路中突触连接以及神经递质的细胞定位。

免疫电镜技术最大的挑战在于难以在结构完整性与阳性信号之间实现平衡。通过预包埋免疫电镜技术，我们首次提供了免疫化学验证的超微结构证据，证实了融合性突触的存在，并揭示了小鼠视网膜中突触结构、明确的分布模式、新颖的有机细胞特征以及突触组织或SPIR。

所有研究结果表明，视锥细胞与视杆细胞通路之间的相互作用远比此前假设的更为广泛。这些通过神经化学方法鉴定的超微结构结果表明，在视网膜外丛状层（OPL）中，ON信号与OFF信号可能通过化学突触相互连接。首先，在工作平台上准备好解剖显微镜、两把尖头镊子、剪刀、一支1毫升注射器针头以及滤纸。

接着，使用弯头剪刀从一只已麻醉的小鼠身上摘除眼球。将眼球置于一个玻璃培养皿中，皿内含有4%多聚甲醛和0.2%苦味酸溶于0.1摩尔磷酸盐缓冲液的固定液。在解剖显微镜下，用1毫升注射器在角膜缘处穿刺打孔，然后用剪刀剪除前节组织。

使用镊子从视网膜内表面取出晶状体。然后用两把镊子小心地剥离巩膜，直至视网膜完全从眼杯中分离。随后，将视网膜切成四块。

用4%多聚甲醛溶液固定过夜后，用0.01摩尔PBS缓冲液洗涤视网膜组织，每次10分钟，共洗涤六次。将视网膜组织置于含1%硼氢化钠的0.01摩尔PBS缓冲液中孵育30分钟。再次用0.01摩尔PBS缓冲液洗涤视网膜切片，至少洗涤六次。

然后，用滤纸去除玻璃体。使用双刃剃须刀片将视网膜切成100至300微米之间的小片。用0.01摩尔的PBS缓冲液洗涤视网膜条，每次10分钟，共洗涤6次，随后将其与ABC试剂盒中的试剂A和试剂B共同孵育两天。

接下来，用 0.05 摩尔 Tris 缓冲液清洗视网膜条带，每次 10 分钟，共清洗三次。将视网膜条带在二氨基联苯胺（DAB）试剂盒中的试剂 1 和试剂 3 各 5% 的蒸馏水溶液中室温预孵育一小时。使用 DAB 对视网膜条带进行染色时，依次加入 DAB 试剂盒中三个试管内等体积的溶液。

在解剖显微镜下观察染色情况。用 0.05 摩尔 Tris 缓冲液洗涤视网膜条，每次 10 分钟，共洗涤三次。最后用 0.01 摩尔 PBS 洗涤六次，每次 10 分钟。

在对照实验中，具有两个突触带的视锥细胞终足和具有一个突触带的视杆细胞球状终末在未加一抗的情况下未显示免疫反应性。蛋白激酶Cα用于标记视网膜中的视杆双极细胞。DAB染色显示蛋白激酶Cα存在于视杆双极细胞的树突中，这些树突在外界丛状层与视杆和视锥终末形成突触。

此外，DAB反应产物有助于识别内丛状层中的杆状双极细胞终末及轴突过程。P物质免疫反应性无长突细胞被证实为P物质阴性无长突细胞的突触前细胞。进一步地，P物质免疫反应性无长突细胞分别在内丛状层的第三亚层和第五亚层水平上，作为双极细胞终末的突触后细胞。