从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

本实验的总体目标是从病变的人类心室组织样本中分离出具有活性的心肌细胞，并表征其功能改变。首先，需迅速采集新鲜的心室样本，并在冰冻的停搏液中进行剪碎处理，以避免组织过度降解和细胞损伤，从而实现这一目标。第二步是使用定制的消化装置和酶溶液，对心肌组织块进行逐步消化。

经过六个循环后，每个循环中含细胞的缓冲液均收集至离心管中，并用细胞保存液进行稀释。最后一步是将六个离心管中的细胞重悬于体积较小的标准生理溶液中，该溶液含有正常浓度的钙离子，以进行功能表征。最终，通过膜片钳记录动作电位，同时利用荧光染料检测细胞内钙离子水平，以展示肥厚型心肌病患者心肌细胞的动作电位时程及细胞内钙离子循环的改变。

DYS unique 方法相较于16法（如标准的组织块排出法）的主要优势在于，在酶解液的作用下，我们使用了一种特制的消化装置，该装置凭借其硅质刮片可实现细胞的有效解离。该方法有助于回答心脏病学领域的一些关键问题，例如，已知与心脏疾病相关的分子和结构重塑如何体现在单个心肌细胞的改变上，而这些改变可通过我们的方法进行分析，并成为特定药物的作用靶点。因此，该技术的应用前景可延伸至肥厚型心肌病等遗传性心脏病的治疗领域。

事实上，该方法可用于对接受过心脏手术的肥厚性或缺血性心脏病患者的心室心肌细胞进行新型神经病理学方法的测试。我们最初是在比较人类动脉标本与心脏手术期间获取的心室活检组织之间的相似性时提出了该方法的想法。开始操作时，将40毫升停跳液倒入50毫升离心管中，并置于冰上，用于将标本从手术室快速转运至细胞分离实验室；将标本迅速转移至实验区域，并在切除后10分钟内开始标本处理。

从手术室获取切除后的集体心室心肌标本，立即用冰冻的CP溶液清洗，并将标本置于冰冻CP缓冲液中保存于试管内。随后使用精细剪刀小心去除心内膜纤维化层。

将心肌组织切成2至3毫米长的小块，每次分离所用的心室心肌总量介于100毫克至1克之间。将组织块转移至消化装置的刮取室后，用冰冷的无钙解离缓冲液替换腔室中的CP缓冲液。然后将消化装置置于恒温水浴中。

将浴槽温度设置为 37.5 摄氏度并开启。接着打开消化装置的电机，将转速设定为每秒一转。用 DB 进行三次洗涤循环，每隔八分钟用 37 摄氏度、经氧气饱和的干净 DB 更换 chamber 中的溶液。

随后，向 DB 溶液中加入终浓度为每毫升 250 单位的 5 型胶原酶和每毫升 4 单位的蛋白酶 24 型，配制酶缓冲液一。然后通过向 DB 溶液中加入终浓度为每毫升 250 单位的胶原酶，配制酶缓冲液二。

向DB溶液中加入5毫升已通氧的EB1溶液，并将其预热至37摄氏度。随后，在旋转消化装置中，使用3毫升100%通氧的EB1溶液在37摄氏度下进行两次消化循环，每次持续12分钟。每次循环结束后，用移液器吸除溶液并弃去。

接下来，准备六个15毫升离心管用于细胞收集，并准备80毫升4摄氏度的craft brew溶液，以去除缓冲液中氧合的EB2，并将其升温至37摄氏度。随后，在37摄氏度下使用3毫升100%氧合的EB2进行第一次15分钟的消化。消化结束后，收集含有首次解离心肌细胞的溶液至15毫升离心管中，并用12毫升冷KB溶液稀释细胞悬液。

将离心管平放于室温下，用3毫升EB2溶液在37摄氏度下进行另外五次12分钟的消化循环，每次循环后收集含有心肌细胞的缓冲液至15毫升锥形管中。每次循环后，记得将收集的3毫升缓冲液用12毫升KB溶液稀释。最后，将六个含有细胞的离心管置于室温下保存。

在此步骤中，向 20 毫升无钙 Tyro 缓冲液中加入 1 毫克/毫升的牛血清白蛋白。然后过滤该溶液，接着将含有心肌细胞的 6 个锥形管在 100 ×g 条件下离心 5 分钟。为促使心肌细胞沉淀，弃去上清液，并在室温下用含牛血清白蛋白的 TB 缓冲液以可变量重悬各管中的细胞。

通过在第一步和第二步中逐次加入少量 100 毫摩尔/升的氯化钙溶液，逐步提高细胞悬液缓冲液中的钙离子浓度。钙离子浓度分别升至 50 微摩尔/升和 100 微摩尔/升。随后每五分钟进行一次钙离子添加步骤，每次浓度增加 100 微摩尔/升，直至最终浓度达到 0.9 毫摩尔/升。

为评估分离过程的得率，将0.5毫升含心肌细胞的溶液转移至显微镜的玻璃底培养皿中。在10倍物镜放大倍数下观察15个显微镜视野，并计算健康心肌细胞所占百分比，健康细胞表现为杆状、横纹清晰且无明显包涵物。预期得率约为20%，以用于开展人类心肌细胞功能评估，包括动作电位与细胞内钙离子流的同步记录。

首先，配制用于穿孔膜片钳实验的电极内液。然后向无钙台氏液中加入1.8毫摩尔的氯化钙。在膜片钳荧光实验中，用该溶液灌流心肌细胞。

接下来，将一毫升细胞悬液转移至一个 1.5 毫升离心管中，加入 10 微摩尔/升 Fluoro-4 AM 和 10 微升 PowerLoad。将离心管水平放置，在室温下孵育 30 分钟。随后，将离心管垂直放置，静置五分钟使细胞沉降。

然后用移液器吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于含钙的 tb 中。取 25 毫升细胞悬液转移至置于显微镜载物台上的小型控温记录槽中，通过重力灌流系统以每分钟 0.3 毫升的流速、在 37 摄氏度条件下进行灌流。

使用显微拉针仪制备膜片钳电极，使其尖端直径为3至5微米，当充满PS溶液时电阻为3至4.5兆欧。随后，将两性霉素B加入PS溶液中，使其终浓度为250微克/毫升，并用该溶液填充电极，然后将电极安装至电极夹持器上。接下来，选择呈杆状、横纹清晰且无颗粒物包涵体的细胞。

形成吉伽封接，并等待5到10分钟，直至接入电阻降至20欧姆以下。随后，在电流钳模式下使用不同频率的短脉冲刺激诱发动作电位。在记录阶段，打开492纳米的明场照明，并在505至520纳米范围内检测Fluor fort荧光信号。

然后采集荧光和膜电位信号。该图显示了来自HCM样本的心室心肌细胞动作电位的改变。以下是分别在0.2赫兹、0.5赫兹和1赫兹刺激下记录的对照心肌细胞和HCM心肌细胞的代表性叠加动作电位。

来自对照心肌细胞在0.5赫兹时叠加的动作电位。图中显示了在无和含有10⁻⁷摩尔异丙肾上腺素条件下的情况，此处还展示了一条来自肥厚型心肌病（HCM）患者心肌细胞的膜电位代表性轨迹，该轨迹表现出多次自发性去极化及早后去极化。该图显示了来自HCM样本心室心肌细胞钙瞬变的改变。

以下是通过膜片钳电极以 0.2 赫兹刺激频率在对照心肌细胞和肥厚型心肌病（HCM）细胞中记录到的代表性叠加钙瞬变。图中展示了 HCM 和对照组心肌细胞在不同时程下的钙瞬变动力学，以及代表性长时程记录，显示在三种不同刺激频率下细胞内钙的变化情况，突出显示了 HCM 心肌细胞在高起搏频率时舒张期钙水平升高。该图展示了利用人左心室心肌细胞进行的其他实验应用。

左侧显示的是在不同膜电压下记录的L型钙电流的代表性叠加曲线，右侧显示的是来自18个肥厚型心肌病（HCM）样本分离的心肌细胞在不同膜电压下的平均L型钙电流峰值密度；此处还展示了在1赫兹电场刺激下记录的一个心室肌细胞的胞内钙瞬变曲线。在进行该操作时，必须注意在从手术室获取标本后尽快开始实验操作，以确保细胞活性。按照本方案可成功分离人心室肌细胞。此外，还可在此基础上开展其他实验方法，如共聚焦显微镜观察或免疫组织化学分析，这对于回答一些基础科学问题至关重要，例如，心脏疾病状态下膜结构和钙释放单位的亚细胞定位如何发生改变。

该技术为细胞心脏病学研究心室心肌细胞的功能异常以及验证新型治疗手段的潜在应用价值奠定了基础。观看本视频后，您应能充分理解如何从人体样本中分离出具有活性的单个心肌细胞，以及如何在不同条件下对细胞功能进行表征。