从人心脏组织中分离血管周围多能前体细胞群体

本实验的总体目标是从人的心脏组织中分离出两种不同的多能血管周前体细胞群体。该方法可能有助于解答心脏再生领域中的一些关键问题，例如血管周细胞群体中不同亚群对此过程的贡献。该技术的主要优势在于所获得的前体细胞群体异质性更低，且与多种传统的贴壁培养技术相比，细胞活力更佳。

该技术可能对缺血性心脏病的治疗具有重要意义，因为已发现血管周围干细胞亚型具有心肌生成潜能。尽管该方法可为血管周围细胞在心脏再生中的作用提供见解，也可应用于其他心脏疾病方面的研究，例如心肌纤维化。通常，初学者由于组织新鲜度影响活细胞的使用，会在操作中遇到困难。

开始此操作时，先去除心包、主要血管和心房，将样本置于培养皿中的洗涤液中。接着，将心室心肌切成约一立方毫米的小块，并立即进行处理，以获得最高的细胞得率。然后，配制新鲜的消化液，并在水浴中将其预热至37摄氏度。

随后，将悬浮的组织碎片通过100微米细胞筛过滤，并用PBS洗涤两次。将组织碎片转移至一个带有紧密封盖的无菌30毫升容器中。加入消化液，将容器置于密封的塑料袋内，放入设定为37°C、120 RPM的摇动水浴箱中。

孵育15分钟后，将容器倒置三次，然后放回水浴中继续孵育15分钟。随后取出，并加入5毫升含20% FBS的DMEM终止胶原酶反应。

随后，使用10毫升血清移液管轻柔吹打消化后的组织10至20次，以分散任何组织团块。接着，将悬液依次通过100微米、70微米，最后通过40微米的细胞滤网过滤，以获得单细胞悬液。此后，将细胞悬液在200 × g下离心4分钟。

小心倾去上清液，将沉淀物重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中，室温孵育2分钟，然后加入4毫升洗涤液进行稀释。重复离心步骤，将沉淀物重悬于1毫升洗涤液中。取10微升细胞悬液与90微升洗涤液混合，制成1:10稀释的细胞悬液。

取10微升稀释后的细胞悬液与10微升台盼蓝染液混合，将10微升混合液加入标准血细胞计数板中进行细胞计数。在此步骤中，向细胞悬液中加入50微升小鼠血清，在4°C孵育20分钟，以阻断非特异性抗体结合。接着，将细胞悬液在200 × g离心4分钟。

弃去上清液，并将沉淀重悬于洗涤液中。随后，取50微升细胞悬液分装至两个聚苯乙烯圆底流式细胞术管中，用于同型对照和未染色对照；将剩余体积置于第三个管中用于多色染色。向单细胞悬液中加入五种抗体，用于多色染色。

轻轻吹打以将抗体与细胞混匀，将所有离心管置于4°C避光孵育20分钟。取五个流式细胞术管，每管中加入一滴阳性微珠至100 µL洗涤液中，制备补偿对照微珠。将抗体分别加入这五个管中。

然后，将所有试管置于4°C避光孵育20分钟。在此期间，准备细胞收集管，每管加入500 µL EGM-2培养基，并将其置于4°C环境中。抗体孵育结束后，加入5 mL洗涤液以洗涤细胞和磁珠，去除未结合的抗体。

将所有离心管在200 × g下离心4分钟。重复洗涤和离心步骤，并小心弃去上清液。然后，将细胞重悬于洗涤液中，浓度为每250 µL含1 × 10⁶个细胞。

随后，将磁珠重悬于 100 µL 洗涤液中。将细胞和磁珠悬液置于冰上避光保存，并转移至细胞分选仪。向阳性磁珠补偿对照管中加入一滴阴性磁珠，并用其设置荧光补偿。

然后，运行未染色的对照细胞以确定背景荧光并设定电压。随后，运行同型对照以确定与非特异性结合相关的背景荧光阈值。接着运行多色染色样本，并将周细胞和外膜细胞群体收集到收集管中。

在此步骤中，每平方厘米生长面积加入100微升无菌的0.2%明胶溶液，并手动振荡以充分覆盖所有孔壁。随后，将培养板置于4°C下孵育10分钟。然后，彻底移除明胶溶液。

在准备培养板的同时，将收集的细胞置于冰上。随后，将新鲜收集的细胞在 200 × g 离心 4 分钟，并用适量 EGM-2 轻柔重悬细胞沉淀。之后，将细胞接种至明胶包被的培养板中。

在该图中，首先对活细胞进行设门，排除 CD45 阳性细胞，随后排除 CD56 阳性细胞。然后从 CD56 阴性组分中去除 CD144 阳性的内皮细胞。从最终的细胞群体中，分别筛选并收集 CD146 阳性、CD34 阴性的周细胞以及 CD146 阴性、CD34 阳性的外膜细胞。

FACS纯化的心肌周细胞和外膜细胞培养物均呈现纺锤形至星状的细胞形态。若操作得当，掌握该技术后整个过程约需五小时。在进行该实验时，需牢记最新鲜的样本才能获得最理想的活细胞得率。

通过此操作流程，还可进行其他方法，例如细胞心肌成形术，以回答更多问题，例如这些细胞在缺血性心脏病治疗中的适用性。