使用 HEp-2 细胞进行抗核抗体筛查

以下实验的总体目标是利用间接免疫荧光法检测抗核抗体。该方法通过将患者血清与 Hep-2 细胞底物载玻片孵育来实现。未结合的患者血清被洗去后，已结合的自身抗体再与荧光素标记的特异性二抗孵育，随后洗去未结合的试剂。

通过荧光显微镜观察时，自身抗体阳性样本会显示出苹果绿色荧光，该荧光对应于自身抗体结合的细胞或细胞核区域，其荧光模式提示相应抗原的存在。最终，RNA抗体的检出可辅助诊断结缔组织病。与其他方法（如固相ELISA）相比，间接免疫荧光法的主要优势在于，Hep-2细胞基质含有超过100种以天然构象表达的抗原。

这使得几乎所有的临床相关O型抗体均可被鉴定，而固相法技术无法实现这一点，因为间接免疫荧光法是一种高度专业化的技术。初学者需要一定的时间和实践才能熟练掌握载玻片处理的操作流程。解读显微镜图像并学会识别相关荧光模式也是一项需要长时间积累才能掌握的技能。

使用正确的试剂和工具，结果将更加一致且易于解读。本实验操作将由免疫荧光分析开发实验室的技术员 Cassandra Bryant 进行演示。取出试剂并拆除包装，使各组分平衡至室温，按照说明书准备试剂并稀释患者血清，载玻片带有条形码，可轻松整合到自动化系统中。

本实验流程演示了手动切片处理。然而，高通量实验室可选择使用具备条形码扫描功能的自动切片处理设备。Inova 仪器通过一个集中式智能网络连接，可实现对工作流程结果及报告的控制。

用于IFA。这可通过处理和消除转录及相关错误实现对患者的阳性识别。在相应的载玻片上分别加入一滴阳性对照和一滴阴性对照。

用移液器向其余孔中加入20至25微升稀释后的患者血清。每次处理一张载玻片。将载玻片放入染色缸中，缸底放置一张湿润的纸巾，盖上盖子，孵育30分钟。

潮湿的环境可防止底物干燥，否则可能导致人为染色现象。在孵育期间，患者血清中的抗核抗体将与固定在每个孔中的细胞抗原结合。孵育结束后，使用轻柔的洗涤缓冲液冲洗液洗去血清，以避免损伤底物。

将载玻片略微倾斜，使液体流不直接冲击基底。这种放置方式还有助于防止不同孔之间的样品交叉污染。轻敲去除多余的洗涤缓冲液，然后将载玻片放入盛有洗涤缓冲液的Copeland染色缸中。

洗涤步骤的孵育时间应约为五分钟。从洗涤缓冲液中取出玻片并轻轻拍打。为去除多余的洗涤缓冲液，向每个孔中加入一滴荧光偶联物。

对于中和抗体检测，建议使用针对IgG FC的特异性偶联物。将切片在湿盒中孵育30分钟，并确保更换染色盖片。该偶联物对光敏感，盖片可保护切片免受光照。

在孵育期间，偶联物将与已结合于细胞抗原的患者抗核抗体结合。这种偶联物的结合会导致孵育后孔中出现荧光。用洗涤缓冲液洗涤玻片。

与之前相同，将盖玻片放置在纸巾上，并将封片剂连续地涂抹在盖玻片的底边。从洗涤缓冲液中取出每张载玻片，轻轻敲击载玻片。为去除多余的洗涤缓冲液，将载玻片的下边缘接触盖玻片的边缘。

将载玻片轻轻盖在盖玻片上，使盖玻片上的封片剂均匀流至载玻片的顶端边缘，避免产生气泡。使用适量的封片剂是一项需要练习才能掌握的技巧。将玻片置于暗室中的荧光显微镜下，应使用 20 x 或 25 x 物镜对整个孔进行扫描。为评估细胞分布及荧光均匀性，切换至 40 x 物镜进行观察。

为了最终判断阳性结果及染色模式，请观察阳性对照和阴性对照。阴性对照可能并非完全黑暗，但通常会显示低水平的非特异性荧光。阳性对照将在细胞核内呈现明亮的苹果绿色荧光。

可通过从一加到四加的反应性分级量表对阳性结果进行分级。除了人工判读外，载玻片还可由自动荧光显微镜进行装载和扫描。无需暗室。

选择适当的载玻片类型创建项目后，仪器将获取并存储每个孔中细胞的高分辨率数字图像。此外，Nova View 可测量荧光强度，将结果分类为阳性或阴性，并对阳性样本提供模式识别。操作人员可在高分辨率计算机显示器上查看图像，从而对 Nova View 的结果进行最终判读、修正和确认。

可对确认的结果生成结果报告。自身抗体与细胞核内组成蛋白结构的结合可产生五种主要的核型模式，包括均质型、颗粒型、着丝点型、核仁型和核点型。要识别此处所示的均质型模式，需先识别有丝分裂或正在分裂的细胞。

有丝分裂期细胞呈现均匀的强荧光，通常比静止期细胞更明显。静止期细胞的细胞核应呈现均匀的弥散性染色。这种特征性模式最可能是抗双链DNA自身抗体所致。

斑点型模式的一个关键特征是中期有丝分裂细胞呈现裂隙状外观。这些细胞的染色体区域为阴性。静止期细胞在细胞核内呈现遍布的斑点状模式。

核染色的颗粒模式可分为粗颗粒型和细颗粒型。粗颗粒型通常由针对SM和RNP的自身抗体引起；细颗粒型则可能由针对S-S-A、S-S-B以及RNA聚合酶的自身抗体所致。

DFS 模式被称为密集细颗粒型，提示存在针对 DFS 70 的自身抗体。有丝分裂细胞显示颗粒状染色，而静止期细胞则在整个细胞核内呈现均匀分布的细小颗粒。在这些情况下，应进行确证性检测，因为与结缔组织病患者相比，DFS 70 自身抗体在健康个体中更为常见。

为了识别着丝粒模式，需扫描各孔并鉴定有丝分裂或正在分裂的细胞。分裂期细胞具有大量彼此紧密关联的细小斑点，通常称为中期板。静止期细胞则显示约40至60个离散的斑点，分布于整个细胞核内。

着丝粒型模式与针对核仁型模式的着丝粒蛋白的自身抗体相关。在有丝分裂细胞中，染色体区域的染色表现具有可变性。核仁型模式表现为细胞核均质或颗粒状染色，同时伴有静止期细胞核核质的弱强度、颗粒状或均质染色。

该模式与抗RNA聚合酶III、抗纤维蛋白以及抗PM-Scl抗体相关。核点型模式表现为分裂期细胞核呈阴性，有丝分裂细胞以及静止期细胞核内可见少数离散的点状结构。这种特征性模式通常由抗SP100、抗PML或抗P80着丝粒蛋白的自身抗体所致。

这些抗体与原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎相关。在所示图像中，核点型模式因针对线粒体抗原的自身抗体而显示出细胞质染色。抗核抗体的检测与模式识别是辅助患者诊断的重要工具。

了解各种荧光模式的意义，有助于临床医生和实验室人员进行适当的随访检测。正确识别抗核抗体模式最重要的因素是选择高质量的细胞基质，并以稳定且良好的技术处理载玻片。载玻片的判读传统上在暗室中通过荧光显微镜进行，由经过培训的技术人员完成，这些人员熟悉在细胞周期和细胞形态背景下出现的各种荧光模式。

近年来，已开发出用于自动读取载玻片的数字成像系统，这类仪器可实现工作流程自动化，并提高读片和判读的一致性。此外，通过使用条形码载玻片，可在整个过程中实现样本的可追溯性，消除潜在的转录错误，提升数据完整性和患者安全性。观看本视频后，您应能充分理解间接免疫荧光实验每一步操作的正确执行方法，并能够识别具有临床意义的抗核抗体模式。