一种用于评估小鼠肝细胞核多倍性的高通量原位方法

该方法可使用户从二维组织切片中生成肝细胞核DNA含量的分析图谱，用于研究肝脏发育、再生及慢性疾病。这种自动化高通量方法适用于所有二维肝组织切片，可对所有形态简单的圆形肝细胞核提供内部校准的核倍性读数。肝细胞核倍性的改变与衰老、慢性肝病及癌症相关。

该技术为分析固定或冷冻保存的肝脏样本中的细胞核倍性提供了一种简便方法。原位倍性分析方法在肝病进展的研究和临床应用中具有重要潜力，因其无需组织解离或新鲜组织样本。在获取小鼠肝脏组织样本后，将肝小叶包埋于充满最佳切割温度介质的冷冻模具中，并立即将模具置于干冰上，以确保快速冷冻。

为获得冷冻肝小叶样本的切片，将样本切成6 µm厚度，并将标记好的聚酰胺涂层载玻片置于每个切片上5秒，使切片粘附于载玻片。待所有切片收集完毕后，于室温下平衡3至5分钟，再进行免疫标记。平衡结束后，在通风橱中用1 mL含4%多聚甲醛的PBS溶液于室温固定组织切片10分钟。

固定结束后，用 PBS 轻轻振荡洗涤载玻片，每次 3 分钟，共洗涤 3 次。最后一次洗涤后，吸干每张组织切片周围的液体，并使用疏水笔在每个样本周围画圈。为使样本通透，将切片置于含 0.5% 非离子型表面活性剂的 PBS 中，室温孵育 15 分钟。

孵育结束后，用 PBS 轻轻振荡洗涤样品两次，每次三分钟。随后，在室温下用含 1% 牛血清白蛋白、5% 马血清和 0.2% 非离子型表面活性剂的过滤 PBS 溶液封闭非特异性结合位点，封闭时间至少为一小时。接着，在湿染盒中，于 4 摄氏度下避光孵育切片与 HHF4-alpha 抗体（用封闭缓冲液稀释），过夜。次日早晨，在湿染盒中室温避光条件下，用 PBS 轻轻振荡洗涤切片四次，随后加入合适的荧光标记二抗以及 Hoechst（溶于含 1% 过滤牛血清白蛋白和 0.2% 非离子型表面活性剂的 PBS 溶液中），继续孵育两小时。

孵育结束后，按所示方法洗涤载玻片四次，随后用双蒸水轻轻振荡洗涤两次，每次三分钟。最后一次洗涤后，在盖玻片上滴加两滴荧光封片剂，将样品封片，必要时施加轻微压力以排除气泡。然后使用常规荧光显微镜检查载玻片，以确保固定和免疫标记效果良好。

进行荧光图像采集时，在高内涵成像平台上设置参数，使用与所用荧光染料相匹配的激发光来获取荧光图像。随后扫描样品，获取足够数量的图像以完全覆盖组织切片。扫描结束后，调整软件中的核分割参数，确保细胞核得到最佳分离，并调节阈值强度，以实现对HNF4-alpha阳性肝细胞和HNF4-alpha阴性非实质细胞的最佳圈选。

进行细胞核定量时，根据 Hoechst 染色设定细胞核面积（平方微米）、主要细胞核 Hoechst 强度、细胞核伸长因子、平均细胞核圆度指数、HNF4-α 状态，以及基于重心位置的细胞核 X、Y 坐标。为执行肝细胞核倍性分析，首先下载并安装倍性定量分析程序。在 MATLAB 中，转至功能区的“App”选项卡，然后单击“安装 App”。

打开倍性分析 ML 应用安装程序。将出现一条消息，确认安装成功。在每个数据分析文件中，需包含一个名为“细胞测量”的工作表，其中按指定列排列进行倍性分析所需的所有数据。

针对每个实验条件，提供一个对照数据集，用于计算二到四倍体核相校准的内部对照。对于生物学重复，将每个电子表格存储在独立的文件夹中，文件夹名称前缀依次递增。然后，启动Ploidy应用程序。

将出现Ploidy应用程序的图形用户界面。单击“Path to Control Data”按钮，导航至存放对照数据重复样本的文件夹。该数据路径将显示在界面中。

在“文件夹前缀”中，输入输出文件的名称。单击“指向其他数据的路径”按钮，然后浏览至包含对照数据重复样本的文件夹。该数据路径将显示在界面中。

然后点击运行。分析完成后，状态栏将显示“分析完成”。免疫标记后，必须通过常规荧光显微镜检查所有载玻片，以确认已获得高质量的固定和染色效果。

Hoechst 染料出现弥散或模糊现象可能表明固定不充分，或在固定前样本已发生降解。在进行自动图像分析之前，应仔细优化细胞核分离和 HNF4-alpha 阈值参数，以广泛反映荧光显微镜下观察到的免疫荧光染色的视觉模式。图像分析完成后，数据应体现出随着 DDC 损伤的发生，肝脏中非实质细胞数量增加，同时 HNF4-alpha 阳性细胞核数量虽少但具有显著性地减少。

在健康对照肝脏中，约有63%的HNF4-alpha阳性细胞核呈现简单的圆形形态计量特征。对照组与DDC处理组之间相对核倍性比较应反映出损伤导致2C和4C肝细胞核显著减少，同时大于8C的细胞数量增加。通过在高内涵图像分析软件中检索特定肝细胞亚群的二维位置，可进一步分析各倍性亚群的相对空间分布信息。

可使用其他抗体（如 Ki-67）进行免疫标记，以评估细胞复制情况，并可进一步分析肝细胞核形态计量数据，以补充倍性分析。该方法生成的组织范围倍性谱可描述所有圆形肝细胞核的最小DNA含量，但无法区分单核细胞与双核肝细胞。该方法有望进一步优化，以纳入细胞周长等参数，有助于识别双核细胞，并提供细胞倍性的额外读出指标。