依次 体内 骨折修复过程中成骨干细胞/祖细胞的成像

本实验的总体目标是依次追踪并定量分析内源性成骨干细胞及其祖细胞在骨骨折修复过程中的迁移、增殖和分化。该目标首先通过向体内注射聚胞苷酸（poly-cytidylic acid）标记混合病毒、流感病毒抗性基因MX1（MX one）阳性细胞，随后通过照射清除体内原有的MX1阳性造血细胞来实现。第二步，系统性地将野生型骨髓细胞注入经照射的小鼠体内。

接下来，通过针头钻孔在小鼠胫骨区域诱导产生微骨折。最后，对微骨折修复过程进行连续的活体成像。最终，这些活体图像可用于评估成骨干细胞及其前体细胞向骨折部位迁移和扩增的动力学过程。

因此，该技术的主要优势在于能够在骨折愈合过程中对成骨干细胞及其前体细胞进行活体重复成像。该技术的应用前景可拓展至骨折愈合及骨质疏松症的治疗，因为该方法为监测骨骼再生与修复过程中内源性的成骨干细胞及其前体细胞提供了新的工具。

该方法的可视化演示至关重要，因为产生微骨折时需尽量减少组织损伤，同时在体内反复成像骨折损伤过程又不引起严重瘢痕形成，这对该方法的成功实施具有重要意义，但在技术上具有挑战性。为了在体内标记Mx1阳性细胞，首先向Mx1-Cre报告小鼠按每20克体重腹腔注射200微升多聚酸性多聚胞苷酸，每隔一天注射一次，共持续10天。随后，为清除体内原有的Mx1阳性造血细胞，对注射过的小鼠进行单次9.5 Gy剂量的照射。照射24小时后，每只小鼠通过静脉移植1×10⁶个野生型骨髓细胞。

四周至六周后，通过腹腔注射 50 微升氯胺酮-甲苯噻嗪混合物使小鼠麻醉。通过脚趾夹捏确认麻醉成功后，剪除骨髓细胞移植小鼠的头皮毛发，并用 70% 酒精棉片消毒暴露的皮肤。涂抹眼用凝胶以防止角膜脱水，然后从一侧耳朵开始至另一侧耳朵结束，在头皮上做一个长度小于一厘米的横向切口。接着，将动物体位旋转约 60 度，并使用镊子继续切口，直至距离鼻部约二至三毫米处为止。

将组织瓣向动物两侧牵拉，以分离皮肤，此时额骨及矢状缝与冠状缝的交界处应清晰暴露。用无菌 PBS 冲洗暴露的表面，然后用棉签轻轻擦去残留的毛发。接着，为在颅骨上制造微骨折，用一只手固定小鼠头部，另一只手持 30 号针头。

使用30号针头在额骨一侧靠近矢状缝与冠状缝交界处轻轻钻出一个微小穿刺孔。为避免刺入脑组织，更换为较粗的针头，并旋转新针头将穿刺孔扩大至直径约0.5毫米。在对侧额骨生成第二个穿刺孔后，持续向每个穿刺点滴加PBS，并擦拭直至出血停止。

然后，为避免干燥，在颅骨上滴加足够量的无菌生理盐水，以完全覆盖待获取Vidal图像的区域。首先打开基于多边形的激光扫描仪，以实现每秒30帧视频速率的同步多通道图像采集。接着打开飞秒钛宝石激光器，用于多光子成像。

将功率和波长设置为880纳米，用于颅骨的二次谐波成像，激发波长为440纳米以激发GFP和TD番茄荧光蛋白；打开491纳米和561纳米的固态激光器。然后打开每个信号对应的光电倍增管探测器：二次谐波成像使用435±20纳米带通滤光片，GFP使用528±19纳米带通滤光片，TD番茄使用590±20纳米带通滤光片。现在，将动物放置在设定为37摄氏度的电加热垫上方的XYZ轴电动显微镜载物台上。

使用胶带固定小鼠位置，然后在颅骨上滴加一滴温热的含2%甲基纤维素的凝胶。为防止干燥，在成像区域加盖盖玻片。接着使用数值孔径为0.9的30倍水浸物镜，并通过XY轴和Z轴控制器检测骨骼产生的SHG信号。

为了确定颅骨表面，需识别一个关键的解剖标志位置，例如矢状缝与冠状缝的交点，并采集图像。标记该标志点的 XY、Z 坐标，然后利用二次谐波生成（SHG）信号和荧光信号作为指引，继续寻找损伤部位。每当发现感兴趣区域时，应采集包含目标细胞的 SHG 信号和荧光信号的最佳焦平面图像。

保存 X、Y、Z 坐标以及到矢状缝与冠状缝交点的距离，以确定下一轮成像时的精确定位。随后采集骨折损伤区域的三维细胞和骨组织结构。从骨内表面开始，以大约 100 微米的深度，以约 2 至 5 微米的 Z 轴步长进行图像采集。

最后，在对两个损伤部位成像后，使用多滴无菌生理盐水清除颅骨上的2%甲基纤维素凝胶。随后在表面涂抹抗生素，并用皮瓣覆盖颅骨，使用低致敏性缝合线闭合头皮，将动物置于温暖的恢复室中，直至其恢复足够的意识。3至5天后，重复活体成像步骤，以追踪骨折愈合过程中细胞的变化。

在此代表性实验中，对经照射并进行骨髓移植的基因型为MX1的番茄标记骨钙素-GFP小鼠的额骨制造了两个微骨折。连续3D活体成像显示，在第2天，番茄阳性成骨干细胞及祖细胞迁移至骨折部位，并在第5天出现扩增。尽管此时未检测到GFP阳性成骨细胞，但在第12天，靠近骨折表面的一部分成骨祖细胞开始分化为番茄阳性且GFP阳性的成骨细胞（如箭头所示）。第21天时新成骨细胞的积累及新骨形成表明，成骨祖细胞的迁移与增殖是骨折愈合过程中提供新成骨细胞的主要机制。为了验证该方法是否可在骨折愈合期间提供一致且定量的成骨祖细胞数量输出，我们在损伤后连续追踪了MX1型YFP阳性成骨干细胞及祖细胞达14天。

伤后三天，在损伤部位持续检测到少量前体细胞。细胞数量在第七天持续增加，第十天达到峰值，并在第十四天仍维持在较高水平。通过测量随时间变化的YFP信号强度，对成骨前体细胞的生成动力学进行定量，并与活体显微观察结果进行关联分析。

祖细胞在第3天首次被观察到，第10天达到峰值，并在第14天仍保持相似的高水平。在进行该操作时，需注意熟练的缝合技术以及尽量减少出血，有助于减少瘢痕形成并降低背景自发荧光。观看本视频后，您应能够充分理解如何对骨折修复过程中内源性成骨干细胞祖细胞的迁移、增殖和分化进行成像与追踪。