三维骨细胞外基质骨肉瘤模型

该方法为骨肿瘤研究提供了制备功能性支架的有效策略。脱细胞骨细胞外基质对骨肉瘤细胞的存活和活性表现出不同的血清相容性。该技术的主要优势在于，骨源性基质中培养的骨肉瘤细胞呈现出高度异质性的形态，类似于临床骨肉瘤的组织病理学特征。

该方法为研究骨肿瘤（如骨肉瘤、尤文肉瘤及其他转移至骨骼的恶性肿瘤）的药物敏感性发生与发展提供了理想的模型。首先，取4至6周龄的BALB/c小鼠，在使用无菌手术剪处死小鼠后，从后肢分离新鲜的腓骨、胫骨和股骨。借助镊子剥离表皮组织，然后尽可能去除全部软组织。

用无菌的10 mM PBS溶液在6厘米培养皿中冲洗腿骨两次，以去除血液。将骨骼浸入盛有75%乙醇的培养皿中3分钟，然后用PBS冲洗两次。将清洁后的骨骼保存在无菌的50毫升离心管中，并加入无菌PBS，于-80摄氏度保存。

将冷冻的骨骼在室温下解冻，然后在 -80 摄氏度下再次冷冻一小时。对骨骼进行两次以上的冻融循环，以实现细胞裂解和组织降解。随后，将骨骼放入装有 0.5 normal HCl 的无菌 50 毫升离心管中，在室温下置于旋转摇床上过夜孵育，并轻轻摇动，以确保骨骼被充分且均匀地覆盖。

脱钙后，彻底倾去盐酸溶液，并用流水冲洗骨骼一小时。随后，使用蒸馏水在轨道摇床上洗涤骨骼两次，每次15分钟。每次洗涤后彻底倾去溶液。

为了提取脱矿骨中的脂质，将骨组织置于含有甲醇与氯仿1:1混合液的50毫升离心管中。用锡箔纸包裹离心管以避光，防止氯仿分解。然后将离心管置于旋转摇床上震荡一小时。

然后，使用镊子将骨骼转移至另一含有锡箔的甲醇管中，孵育30分钟。彻底去除甲醇，并在旋转摇床上用蒸馏水洗涤两次，每次15分钟。弃去最后一次洗涤的水，并在无菌条件下继续操作。

在6厘米培养皿中用无菌PBS冲洗骨骼3分钟。向50毫升离心管中加入40毫升无菌0.05% TE溶液，将骨骼置于37摄氏度二氧化碳培养箱中孵育23小时。弃去TE溶液，随后在旋转摇床上用含90 g/mL氨苄青霉素和90 g/mL卡那霉素的无菌PBS洗涤两次，每次15分钟。

最后一次洗涤液完全倾去后，再次加入40毫升含抗生素的无菌PBS。在室温下轻轻振荡彻底洗涤24小时，以实现对多孔空间的有效灭菌。然后，将骨骼转移至含有含抗生素无菌PBS的50毫升离心管中。

制备好的骨细胞外基质可在4°C下保存两个月。将BEM放入盛有75%乙醇的培养皿中，手动轻轻摇晃30秒。随后用PBS冲洗两次，每次30秒。

将BEM转移至洁净的六孔细胞培养板中，每孔加入2 mL完全培养基。将BEM置于37°C二氧化碳培养箱中过夜培养。

在含有酚红指示剂的预热 PBS 100 微升中获取人骨肉瘤细胞系。使用移液器将骨肉瘤细胞悬浮，浓度约为 1 × 10⁵。待 BEM 完全浸润培养基后，从 BEM 的近端或远端骨骺处，将针头刺入骨髓腔，并将骨肉瘤细胞注入 BEM 中。

将OS-BEM模型置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育至少两小时，以确保注射的细胞牢固黏附于BEM。随后从培养箱中取出培养板，在板上加入1毫升培养基，并将其置于培养箱中过夜，以完全包被BEM培养表面。

用无菌镊子将OS-BEM模型轻轻转移至六孔板的新孔中，并加入1毫升新鲜培养基。将模型在培养箱中培养14天。在14天培养期间，持续观察培养基颜色变化。

如果培养基变为橙色甚至黄色，应立即更换培养基，弃去一半旧培养基后加入新鲜培养基，以维持骨肉瘤细胞的健康生长环境。持续在倒置荧光显微镜下观察细胞状态。当骨肉瘤细胞扩展至整个培养板时，用无菌镊子轻轻将OS-BEM模型转移至另一个新的孔中。

培养14天后，用PBS轻轻冲洗OS-BEM模型以去除培养基。然后将其转移至15毫升离心管中，加入10%缓冲福尔马林固定，用于组织学鉴定。经过脱矿和脱细胞处理后，BEM相较于天然小鼠骨呈现半透明状，且具有更强的弹性和韧性。

在骨髓腔空间中可清晰观察到少量肌肉残留。天然骨组织与脱细胞骨基质的明场成像显示，细胞核已被彻底清除。脱细胞骨基质中胶原网络的天然多孔结构得到了良好保留。

此外，I型胶原和IV型胶原的免疫组织化学染色显示，脱细胞后小鼠胫骨中细胞外基质的主要成分得以保留。在14天的培养过程中，骨膜和骨内膜均被OS细胞的扩增所浸润。脱细胞骨细胞外基质上的OS细胞表现出高度异质性的形态，类似于骨肉瘤组织切片的细胞病理学特征。

在BEM模型中培养14天后进行免疫组织化学分析，显示出在长期培养中的显著优势。此外，OS细胞和BEM培养均高表达骨基质糖蛋白，该蛋白是类骨质基质的特异性标志物。这种体外三维模型已成功用于揭示骨肉瘤去分化的表型异质性及其调控机制。