可溶性与不可溶性生物素化蛋白的表达、分离与纯化在神经组织再生中的应用

本实验的总体目标是成功设计、表达并分离可应用于多种领域的重组生物素化蛋白，例如探针、传感器、药物递送和组织工程。首先通过小规模培养，将定制设计的质粒转化至细菌宿主细胞系中，随后诱导目标蛋白的表达。接着，确定目标蛋白的存在及其溶解性，以制定合适的纯化方案。

然后扩大实验规模以获得更多的目标蛋白产量，并利用亲和层析技术进行分离。最后，对蛋白质进行纯化并浓缩，用于后续应用和分析。最终通过SDS-PAGE和FPLC结果验证重组蛋白已成功分离和纯化，并进一步检测其功能活性。

重组蛋白工程的主要优势在于，它使我们能够大规模或以毫克级产量制备按特定科学需求设计的定制蛋白质。例如，我们可以在这些蛋白质的特定区域添加新的功能元件，从而赋予其新的特性。今天我们将向您展示如何对特定蛋白质的末端进行生物素标记，并利用这一技术将这些蛋白质特异性地固定或锚定在表面，以调控细胞功能，如神经元的轴突生长或神经元分化。

初次使用该技术的研究人员在遵循天然或非天然蛋白质分离的操作步骤时，不应遇到太大困难。许多操作步骤相同，但需要使用针对天然或非天然条件配制的特定缓冲液。在实验初期需仔细注意细节。

转化和测试表达阶段将确保在后续的最终放大过程中获得高蛋白产量。该方法的可视化演示非常重要，因为它展示了如何使用简单的实验室设备和试剂来制备重组蛋白。通过简单的分批反应，可在大规模培养中同步扩增等量的诱导剂与培养基，每个主培养体系可产生10毫克蛋白。

此外，可以使用并演示色谱技术，以展示蛋白质如何进一步纯化用于下游应用。今天，研究生Alicia将来自Cinema实验室，演示该实验流程。在克隆目标蛋白基因并检测其表达，以及将20毫升培养物过夜培养后，根据文本方案，将过夜培养物倒入1.8升含氨苄青霉素的无菌培养基中，并使用巴斯德移液管加入6至8滴无菌消泡剂204。将培养物置于37°C水浴中，通过0.2微米滤器，利用通气石向培养物中通入压缩空气。当培养物的OD600达到0.7至0.8时，加入终浓度为1毫摩尔的IPTG，在37°C诱导表达4小时，或在18°C过夜诱导，具体条件取决于目标蛋白在前期表达测试中位于可溶性组分还是不溶性组分。

收集细胞的实验步骤：将培养物转移至一升离心瓶中，在4°C条件下以14,000 × g离心15分钟。倒去上清液，用刮刀将细菌沉淀刮下，分装至两个50毫升离心管中。再次短时离心以沉淀细胞，随后将沉淀物于-80°C保存。

为了进行非天然蛋白质的分离，针对每个冷冻的 大肠杆菌 菌体沉淀物，加入 20 毫升裂解洗涤缓冲液，涡旋并振荡以充分重悬，彻底消除任何大块沉淀物。

在诱变剂中过夜孵育后，溶液将呈现为黏稠的浆状物，需在20,500 ×g及室温下离心30分钟。将上清液转移至新的离心管中，弃去沉淀，用于天然蛋白质的分离。

将沉淀重悬于裂解缓冲液中，终体积为30毫升，重悬后的沉淀置于冰上。将超声仪设置为30%的振幅，脉冲模式为开启30秒、关闭30秒，超声处理5分钟。超声过程中上下轻轻晃动离心管，以彻底打散细胞沉淀。

将悬液在 20,500 × g、4 °C 条件下离心 30 分钟。然后将上清液转移至新离心管中，弃去沉淀。为对非天然状态分离的蛋白质进行亲和层析，向每根离心管中加入 1 mL 镍-NTA 树脂溶液，并在室温下于旋转仪或摇床中孵育至少 1 小时。

将悬浊液倒入亲和柱中，打开活塞阀，使溶液完全流入废液杯中。待溶液流尽后，向离心管中加入10毫升洗涤缓冲液，以清洗残留的树脂，然后将该溶液加入柱中。用玻璃搅拌棒搅拌树脂，待其完全流尽后，再进行下一次洗涤。

接下来，使用10毫升洗涤缓冲液重复冲洗离心管，并将冲洗液转移至层析柱中。然后用10毫升裂解洗涤缓冲液对层析柱再进行八次洗涤，每次洗涤使用10毫升缓冲液。洗涤完成后，关闭旋塞阀，将废液烧杯更换为50毫升离心管。

向柱中加入 15 毫升洗脱缓冲液，混匀树脂，静置 5 分钟。然后打开活塞，收集 EIT，再用额外的 15 毫升洗脱缓冲液重复操作，以纯化天然蛋白。将镍-NTA 树脂加入蛋白溶液后，在 4°C 下于摇床中孵育至少 1 小时。

使用洗涤缓冲液洗涤柱子10次后，加入5毫升洗脱缓冲液，孵育树脂5分钟，然后在EIT从柱子滴出时，用新的离心管收集大部分EIT。将布拉德福德试剂每孔90微升加入透明的96孔板中。每次用5毫升洗脱缓冲液洗脱后，让10微升溶液从柱子滴入含有90微升布拉德福德试剂的孔中。继续进行EEU操作，直至检测不到蛋白质为止，然后进行透析和/或Rena。

将蛋白质转移至透析管中，并在适当的缓冲液中进行透析，先在4°C条件下透析四小时，然后更换为相应的缓冲液，再于4°C条件下透析两个晚上。使用离心浓缩器将透析后的蛋白质浓缩至小于五毫升，如有需要，可进一步通过八联的尺寸排阻色谱法进行纯化。

根据实验表达方案，NGF 和 SEMA3A 首先在 37 摄氏度下诱导 4 小时，SDS-PAGE 分析确定两种蛋白均位于可溶性组分中。蛋白表达量一般，因此另进行了一次在 18 摄氏度下过夜诱导的表达实验。NGF 在可溶性组分中的表达有所改善，而 SEMA3A 则无明显差异。

在天然和非天然条件下分离NGF，并通过FPLC柱进行纯化。尽管NGF在测试表达期间存在于可溶性组分中，但在37摄氏度和18摄氏度诱导条件下，天然分离均获得较低的产量。然而，通过非天然分离并结合复性，获得了较高的NGF产量。

因此，NGF 在非天然条件下被分离。在 18 摄氏度下过夜诱导后，非天然分离未产生 SEMA3A，而天然分离条件下每 2 升培养物可获得 8.61 ± 3.1 毫克/升的产量。因此，SEMA3A 在 37 摄氏度下诱导 4 小时，并采用天然分离参数进行分离。

收集FPLC峰，并使用SDS-PAGE分析NGF和SEMA3A样品。在SEMA3A的FPLC洗脱液中发现的额外蛋白峰也被收集并进行SDS-PAGE分析，这些峰不在SEMA3A分子量区域。这些组分很可能是降解产物，因为在基于细胞的功能实验中，它们不表现出与SEMA3A相同的生物学活性。

此处指示一个峰。一旦建立并掌握重组蛋白的分离与纯化流程，若操作得当，整个过程仅需数天即可完成。然而，初始的细菌转化及表达测试阶段耗时较长，以准确鉴定蛋白的可溶性。

确定溶解度后，可将转化后的细菌文库保存于-80℃。此外，在蛋白表达后，大肠杆菌菌体沉淀也可保存于-80℃，直至进行后续的分离与实验。在进行该操作时，务必确保缓冲液经过灭菌并新鲜配制，以防止蛋白酶降解和破坏目标蛋白。

每四到六周应配制并灭菌一次裂解缓冲液，透析缓冲液应在蛋白分离前一天配制。为防止多种生物素化蛋白之间的交叉污染，N-I-N-T-A 和 FPLC 柱应根据制造商的方案进行清洗。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用细菌宿主表达系统表达、分离和纯化自行设计的生物素化蛋白。

这与科学界和工业界在小规模和大规模生产中采用的方法类似，因此具有广泛的应用前景。