通过唾液酸聚糖的代谢标记鉴定原代神经干细胞与前体细胞的细胞表面标志物

神经干细胞和祖细胞具有自我更新能力，并可分化为不同类型的神经细胞，支持神经系统的发育，同时为再生医学提供了重要资源。这些细胞具有异质性，因此我们需要了解其特异性的细胞表面标志物，以获得纯化的细胞群体并阐明其功能。本实验方案提供了一种简单、灵敏且高效的检测原代神经干细胞和祖细胞膜蛋白的技术，有助于鉴定这些细胞新的表面标志物。

本方案的主要优势在于能够以更高的灵敏度和特异性直接分析原代神经干细胞及其前体细胞的表面蛋白质组。通过在体外将这些细胞与内皮细胞共培养，并高效激活内在的MAPK-ERK信号通路以标记表面孔蛋白，从而实现这一目标。通过对体外扩增的干细胞进行孔蛋白的修饰优化，本方案可轻松应用于鉴定其他类型干细胞的表面标志物。

为准备内皮细胞，将一个在10厘米培养皿中达到90%融合度的BEN3细胞沉淀用9毫升BEN3细胞培养基重悬。取1毫升细胞悬液加入一个可渗透支持膜小室中。在基质的下室中，每孔再加入2毫升BEN3培养基。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续培养一天。细胞接种至小室后一天，先轻轻吸出下室的培养基，再吸出小室内的培养基。用预热的DMEM洗涤小室表面三次。

用预热的DMEM冲洗插入物的外表面。接着，向一个插入物中加入一毫升预热的AM。将插入物转移至含有原代皮质细胞的孔中。

将共培养物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育12小时。用DMSO溶解Ac4ManAz，配制成200毫摩尔的储备液浓度。从培养箱中取出神经-内皮细胞共培养板。

向每个下室加入 1 微升 Ac4ManAz 储存液，向共培养体系中的每个插入物加入 0.5 微升。将细胞在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 5 天。细胞培养期间，每隔一天向每个插入物加入 100 微升 RM，向每个下室加入 200 微升 RM，以重新喂养内皮细胞和神经细胞。

首先从共培养板中取出插入物，并吸除孔底部的培养基。接着用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤神经细胞一次。吸除孔中的PBS，然后向每孔加入一毫升预冷的含4%多聚甲醛的PBS溶液。

在室温下固定细胞10分钟。然后用预冷的PBS洗涤细胞3次。吸去PBS，每孔加入1毫升新鲜配制的生物素偶联缓冲液1。

室温孵育10分钟。随后，吸去孔中的反应缓冲液，并用PBS洗涤细胞3次。每孔加入1毫升染色缓冲液，室温孵育30分钟。

接下来，吸去各孔中的染色缓冲液，并用预冷的 PBS 洗涤细胞三次。每孔加入一毫升封闭缓冲液，在室温下孵育 10 分钟。移除各孔中的封闭缓冲液，每孔加入一毫升一抗溶液。

将细胞在 4°C 条件下孵育过夜。次日，从孔中移除一抗溶液。用预冷的 PBS 洗涤细胞三次。

吸去孔中的 PBS，每孔加入一毫升二抗。室温孵育细胞两小时。随后吸去孔中溶液，用预冷的 PBS 洗涤细胞三次。

首先，按照文本方案配制 BTTAA 硫酸铜复合物 2、完整蛋白重悬缓冲液、蛋白洗涤缓冲液 1、蛋白洗涤缓冲液 2 和蛋白洗涤缓冲液 3。接着，从共培养板中取出插入物。吸除底部孔中的培养基，并用预冷的 PBS 清洗神经细胞一次。

吸去 PBS，向每孔加入 200 µL 预冷的 RIPA 裂解缓冲液。将培养板置于冰上孵育 5 分钟，然后收集蛋白裂解液至 1.5 mL 离心管中。在 4 °C、12000 ×g 条件下离心 10 分钟，以沉淀细胞碎片。

将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并根据BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。随后，将蛋白浓度调整至1毫克/毫升。向1毫升蛋白裂解液中加入100微摩尔烷基化生物素、2.5毫摩尔抗坏血酸钠以及1×BTTAA硫酸铜复合物2。

充分混匀溶液，并在室温下孵育1小时。随后，将反应液转移至含有20毫升预冷甲醇的50毫升锥形管中。充分混匀后，在-30摄氏度下孵育过夜，以沉淀蛋白质。

在4500 × g、4°C条件下离心15分钟，使蛋白质沉淀形成沉淀物。每次使用20毫升预冷的甲醇洗涤沉淀物，共洗涤两次。随后吸除上清液，并将蛋白质沉淀物重新悬浮于4毫升重悬缓冲液中。

将蛋白重悬液转移至一个新的15毫升锥形管中。用PBS洗涤50微升链霉亲和素珠三次。将洗涤后的珠子加入蛋白重悬液中，在4°C下于垂直旋转仪上以20 rpm的转速孵育3小时。

此后，依次使用此处所示的每种洗涤缓冲液洗涤磁珠。用 20 微升 PBS 重悬洗涤后的磁珠，并转移至新的 1.5 毫升离心管中。加入 20 微升 2× 蛋白上样缓冲液，在 95 摄氏度下处理 10 分钟。

然后按照文本方案中所述，使用SDS-PAGE处理蛋白质样品，并用考马斯亮蓝染色。在本研究中，原代胚胎神经干细胞（NSPCs）在体外进行扩增并进行代谢标记。成功的内皮细胞共培养可诱导NSPCs形成大片状克隆。

使用抗体进行免疫染色显示，在克隆中，大多数细胞为Nestin阳性的神经干细胞/祖细胞（NSPCs），仅有极少数为β-tubulin 3阳性的神经元细胞。相比之下，在非共培养系统中形成的克隆内，Nestin阳性细胞与β-tubulin 3阳性神经元细胞的比例相近。化学探针Ac4ManAz是一种代谢类似物，可被整合到细胞内源性蛋白质的唾液酸化通路中。

对原代NSPCs采用100 µM的优化标记浓度，通过细胞形态和细胞核形态对细胞死亡进行联合评估，结果表明该标记浓度不会引起明显的细胞毒性效应，并能有效标记NSPCs。在内皮细胞共培养体系和非共培养体系中，NSPCs的克隆形态、自我更新能力及分化潜能均未受到影响。通过生物素偶联及链霉亲和素磁珠纯化从Ac4ManAz标记的培养物中制备的蛋白样品，在SDS-PAGE凝胶中显示出强烈的考马斯亮蓝染色信号。

与此同时，DMSO 对照组蛋白样品上样泳道中仅出现染色背景和非特异性结合信号。这也表明 Ac4ManAz 对 NSPCs 的标记效率较高。在尝试本方案时，所有用于生物细胞反应的溶液均需新鲜配制，且应严格控制反应时间，以避免反应过度或不足。

按照我们的方案，可分析富含神经干细胞表面糖链的结构。我们针对富含神经干细胞和祖细胞的表面蛋白的方案不仅可提升标志物的富集效率，而且在该细胞群体的纯化策略以及调控信号通路的解析中发挥重要的功能作用。