利用RNA干扰技术研究小鼠巨噬细胞的先天免疫反应

本实验的总体目标是利用RNA干扰技术，研究候选基因对小鼠巨噬细胞先天免疫反应的影响。为实现这一目标，首先将小鼠巨噬细胞系经胰蛋白酶消化后，与转染溶液及目的siRNA混合，随后将混合物转移至96孔核转染板中，使用Maxa 96孔转染系统将siRNA转入巨噬细胞。转染完成后，细胞在培养基中孵育，随后加入LPS或其他先天免疫激活剂刺激转染后的巨噬细胞。最后，通过ELISA检测细胞因子的产生情况，以评估siRNA处理对先天免疫反应的影响。

与脂质介导的转染技术相比，该方法的主要优势在于其稳定性好，且可高通量地应用于多个基因的研究。本方法的关键在于使用健康的细胞，轻柔处理细胞，并在转染过程中高效操作。正如我们将展示的，本实验方案采用的是 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞系，其培养方法详见随附文档。

在准备 INA 转染板时，将细胞置于 20% 汇合度下培养，培养一至两天，直至细胞汇合度不超过 80%。需注意使用传代次数在第 3 代至第 10 代之间的细胞。解冻后，启动用于转染的 96 孔 Shuttle 系统，并对其进行程序设置，开始此操作流程。

为此，请从连接到穿梭仪的计算机左上角的文件菜单中启动 96 孔板穿梭软件。选择新建参数文件。在显示的 96 孔板示意图上，选中将进行转染的孔。

绿色方框将指示选定的孔。选择与用于原始 2 64 0.7 细胞的巨噬细胞细胞系相对应的程序。选择 DS 1 36，然后选择应用。

请注意，选择程序后，示意图上的孔位将显示颜色。深蓝色空心圆圈表示尚未分配程序的孔位，这些孔位将不会受到电击。接下来，通过将SF细胞系96孔核转染效应液与所附补充剂管中的全部内容物混合，制备工作用核转染效应液。

将混合试剂在室温下平衡。将D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25%胰蛋白酶EDTA和PBS在37摄氏度预热。通过在冰上解冻实验用S-I-R-N-A-P max GFP对照质粒或荧光标记的siRNA，以从细胞培养皿上分离贴壁的巨噬细胞。

吸弃培养基，用 10 毫升 PBS 洗涤细胞两次。去除 PBS 后，每孔加入 1 毫升预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，孵育至细胞开始脱落，通常需要 1 至 2 分钟。

孵育期间轻轻敲击培养板并移动溶液，以最大限度地促进胰蛋白酶消化作用。待细胞脱落后，用移液器轻轻吹打加入9毫升含FBS的DMEM培养基，然后将细胞收集至无菌离心管中。使用血细胞计数板对分离得到的巨噬细胞进行计数。

每个10厘米培养皿预计可获得约1000万个巨噬细胞。计算96孔电穿孔板每孔所需的巨噬细胞总数，每孔需要200,000个细胞。将计算好的细胞数量用移液器加入离心管中。

在室温下以150 × g离心细胞10分钟，收集至无菌的96孔圆底板中，这有助于混合并尽量减少试剂损失。向每个转染孔中加入2 µL的每种siRNA。注意，根据siRNA的数量，此步骤可在巨噬细胞离心过程中同时进行。

该实验步骤中最困难的部分是电穿孔，关键在于对细胞进行轻柔处理并迅速操作。一旦细胞进入具有毒性的转染溶液中，需吸去离心后细胞的培养基，然后将其轻轻重悬于含有补充液的核转染试剂溶液中。

使用多通道移液器立即将细胞转移至无菌槽中，并将20微升重悬的细胞混合液加入含有siRNA的96孔板的每个孔中，通过上下吹打轻轻混匀。接着，将20微升细胞混合液转移至96孔核转染板中。此步骤中必须避免产生气泡，因为气泡可能在核转染过程中引起误差。

将所有实验样本放入转染板后，盖上配套的盖子，并在硬质表面上轻轻敲击。为去除气泡，将96孔板放入96孔核转染器适配器中，在程序界面右下角选择上传并启动。随后根据程序提示，在核转染过程期间成功保存各孔的结果。

转染成功的孔将在屏幕上的96孔示意图中以带加号的绿色圆圈表示。带减号的红色圆圈表示出现错误，最可能的原因是在核转染后立即因气泡或试剂加样体积不正确所致。使用多通道移液器加入80 µL预热的RPMI 1640培养基。

将培养基缓慢加入每侧。让培养基缓慢地与转染后的细胞混合，因为此时细胞非常脆弱。若加入培养基过快，将显著降低细胞存活率。

将转染后的样品和RPMI 1640培养基加入96孔板中，置于37摄氏度、含5% CO2的培养箱内孵育两分钟或更长时间。在进行后续操作前，必须让细胞充分恢复。从培养箱中取出96孔板后，使用多通道移液器小心地将每孔中的混合液转移至新的96孔组织培养板中。

然后，再次使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 µL 含 FBS 的 DMEM。转染后立即孵育 24 至 36 小时，随后进行恢复，并开展流式细胞术检测。为评估荧光标记的 SI siRNA 的转染效率，转染后 24 小时内应有超过 99% 的细胞被成功转染；对于 GFP 质粒的转染效率，应有 30% 至 50% 的细胞表达 GFP。在完成 24 至 36 小时的孵育后，将 LPS 或其他先天免疫激活剂用新鲜培养基配制，将 LPS 稀释至含 FBS 的 DMEM 中，使其终浓度为 20 纳克/毫升。

然后小心地从96孔板中吸除培养基，并向细胞中加入含有LPS的新鲜培养基。将培养板放入培养箱中，在刺激后的不同时间点监测细胞对LPS或其他先天免疫刺激物的反应。用移液器将细胞上清液转移至96孔储存板中，用于后续ELISA分析。

去除上清液以检测细胞活力后，向每个孔中加入100微升1:100稀释的荧光素二乙酸盐（fluorescein diacetate）PBS溶液，在室温下孵育1至5分钟。使用酶标仪检测细胞中的荧光信号，该信号由活细胞内的细胞酯酶切割底物后产生。此化合物经切割后产生荧光，用以说明该方法在监测固有免疫反应中的应用价值。

将靶向已知天然免疫调控基因的siRNA转染至RAW 264.7巨噬细胞系中。随后用LPS刺激细胞，并通过ELISA检测促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的产生，结果如图所示。

抑制Toll样受体4（LPS的受体），但不抑制其他TLR。使用SIR时，LPS诱导的IL-6和TNF-α的产生显著减少。注意，用irna抑制IL-6可降低IL-6的产生，但不影响TNF-α的产生。

这些数据表明，利用siRNA介导的敲低技术针对先天免疫候选调控因子具有良好的效果和特异性。需要注意的是，实现良好转染和细胞高效复苏的关键在于使用非常健康的细胞，在转染和复苏过程中轻柔处理细胞，并在细胞进入核效应溶液后迅速操作。按照本方案，可进一步开展多种其他检测，包括通过定量PCR（QPCR）监测基因敲低效率，以及多种用于研究先天免疫反应的其他实验。