一种用于体内测试巨噬细胞募集的异位趋化因子表达模型

本文所述的方案使我们能够在体内研究趋化因子的功能以及巨噬细胞的行为。目前大多数细胞趋化性实验模型均基于体外细胞实验。然而，体外实验有时过于简单，难以模拟体内复杂的环境。

此外，它们可能无法代表体内趋化能力。这些方法利用了斑马鱼在直接观察细胞行为方面的独特优势，而小鼠则难以实现这一点。首先构建TGFABP-10A白细胞介素-34转基因载体。

将FABP-10A白细胞介素-34构建体与转座酶mRNA共同注射到单细胞期Tg(mpeg1:GFP)转基因鱼和野生型鱼胚胎中。按照文稿说明培育并收集胚胎。随后，用4%多聚甲醛在4摄氏度下固定过夜，或在室温下固定两小时。

固定后，用 PBST 洗涤胚胎三次，每次五分钟。分别用 PBST 中的 50% 甲醇对胚胎进行脱水，随后用 100% 甲醇，再更换为新鲜的 100% 甲醇，并于 -20 °C 下保存至少 2 小时。准备进行探针杂交时，分别在 PBST 中的 50% 甲醇中重新水化胚胎。

随后，用PBST洗涤三次，每次五分钟。在室温下用含蛋白酶K的PBST消化胚胎。然后弃去消化液，并在室温下用4%多聚甲醛重新固定20分钟。

固定后，用 PBST 洗涤胚胎两次，每次 10 分钟。在 65 摄氏度下用预热的杂交缓冲液进行预杂交，至少持续一小时。然后，将白细胞介素-34 探针在 65 摄氏度下预热 10 分钟。

将杂交缓冲液回收至原管中，并在65摄氏度下与预热的探针杂交过夜。次日，在65摄氏度下用50%甲酰胺和2X SSCT洗涤胚胎，随后依次用2X SSCT和0.2X SSCT洗涤。每种洗涤液均重复洗涤三次，每次20分钟。

然后，用PBST清洗胚胎三次，每次五分钟。在室温下用600毫升封闭缓冲液封闭样品一小时。接着加入400微升抗地高辛过氧化物酶抗体溶液，在4摄氏度下孵育胚胎过夜。

第二天，移除抗体，用PBST每次20分钟，洗涤胚胎六次。最后一次洗涤后，用30微升1X扩增稀释液冲洗每个样本，持续五分钟。将样本在荧光素酪胺工作液中避光孵育5至15分钟。

若信号较弱，可将孵育时间延长至30分钟。然后用PBST洗涤胚胎三次，每次10分钟。接着在4摄氏度下与一抗孵育过夜。

第二天，用 PBST 每次清洗胚胎 30 分钟，共清洗五次，并在 4 摄氏度下用二抗孵育过夜。再第二天，用 PBST 每次清洗胚胎 10 分钟，共清洗三次，然后将胚胎置于 70% 甘油中，避光保存于 4 摄氏度或负 20 摄氏度以长期保存。成像前，使用荧光显微镜筛选出 DS red 和 GFP 双阳性胚胎。

为了固定斑马鱼，使用金属浴将1毫升1%低熔点琼脂糖加热至90摄氏度以上，随后冷却至体温，并加入50微升0.2%三卡因。将麻醉后的胚胎转移至底部固定有盖玻片的小型培养皿中。

移除周围的水，将低熔点琼脂糖缓慢滴加到胚胎上。在琼脂糖凝固前，小心调整斑马鱼的位置，使肝脏区域靠近盖玻片。待琼脂糖凝固后，再小心覆盖一层琼脂糖以增强固定效果。

将培养皿置于共聚焦显微镜的载物台上，用含三卡因的 E2 溶液覆盖斑马鱼，并开始成像。操作共聚焦显微镜时，打开 Zen Black 2.3 软件，点击“locate”，然后选择“incubation”，并将温度设置为 29 摄氏度。点击采集菜单，在智能设置菜单中选择所需的扫描模式和激光器。

然后选择Z轴扫描和位置。点击实验设计菜单，选择启用多区块实验，在第一个区块中使用低倍镜找到样本。随后切换至高倍镜，使观察区域位于视野中央。

设置位置和Z轴层扫描信息，然后选择合适的激光强度、扫描层数和成像速度。所有参数设置完成后，设定适当的循环次数并开始记录。

本方案用于将肝特异性白细胞介素-34过表达质粒注射到巨噬细胞标记有GFP的转基因鱼胚胎中。采用全胚胎荧光原位杂交和免疫染色分析白细胞介素-34的表达以及GFP标记的巨噬细胞。对未注射组和注射构建体组胚胎的肝脏及尾部区域的巨噬细胞数量进行了定量分析。

通过活体成像技术，可直接观察被标记为绿色的巨噬细胞从对照组斑马鱼肝脏旁经过，并迁移至过表达白细胞介素-34的斑马鱼肝脏中。该实验方案的关键步骤包括：选择合适的转基因品系以标记目标细胞，选择适合成像的组织以观察转基因的表达，以及确定适当的观察时间窗口。

该技术可用于研究其他趋化因子对其他细胞行为的功能影响，例如体内T细胞和中性粒细胞。