用于再生研究的谐波纳米颗粒

以下实验的总体目标是体外实时监测源自人胚胎干细胞的三维心脏搏动细胞簇，具有高空间分辨率。首先培养并扩增胚胎干细胞，直至其形成拟胚体。随后，将搏动细胞簇分离并接种于聚四氟乙烯（PTFE）多孔滤膜上，从而可长期在气液界面条件下维持培养。

随后，将含有跳动细胞簇的液体培养物用谐波纳米颗粒标记，以进行实时多光子显微成像。所获得的结果可用于在显微尺度上分析心肌收缩的空间伸展性和频率。因此，这些纳米颗粒的主要优势在于可使用任意波长（尤其是红外光），从而实现更深的组织穿透，同时它们在时间上也具有极高的稳定性。

因此，我们可以在长时间范围内监测这些长期过程。这种干细胞培养方法有助于回答三维心肌细胞功能收缩领域中的关键问题，特别是心脏成熟和组织工程方面的研究。

初次使用该疾病新方法的研究人员应注意，使用谐波纳米颗粒的标记步骤仅适用于多光子显微镜，不能转移至其他类型的成像系统。我们最早在2005年提出了将谐波纳米颗粒用于此类研究的想法。与荧光染料和量子点相比，这些纳米颗粒具有明显优势。

事实上，它们的信号不会随着时间推移而衰减，可用于长期监测样品的发育过程。样品制备过程的可视化演示对于各个步骤的效率和可重复性至关重要，尤其是在进行药物测试时，该方法也可应用于不同的组织或疾病研究。组织建模。

根据文本方案培养并扩增人胚胎干细胞（ESCs）后，加入预热的胶原酶孵育4次，每次10分钟，随后在2毫升新鲜分化培养基（DM）中收集集落片段，并以115 × g离心3分钟。将集落片段接种于超低吸附6孔板中进行悬浮培养，培养4天以使其形成拟胚体（EBs）。

然后将新形成的EBS接种于经0.1%明胶包被的24孔板中，培养15至30天，直至出现搏动的细胞簇。吸除PBS，使用Acutase将集落消化为单细胞，经离心和重悬后，将细胞悬浮于DM培养基中，每孔接种2毫升，置于37摄氏度培养箱中培养一天。

培养两到四周后，收集新形成的胚状体（EBS），并将三个胚状体接种至经0.1%明胶包被的24孔板的每个孔中。识别出跳动的心肌细胞簇，使用尖端修长且锋利的移液管进行手动解剖分离。每个插入物中放置四个PTFE滤膜，并将每个插入物置于6孔板的一个孔中。

向每个孔中加入一毫升 DM 后，将一个解剖好的跳动细胞簇加到每张 PTFE 滤膜上。为标记细胞簇，将带有跳动细胞簇的 PTFE 滤膜转移至一个 3.5 厘米的玻璃底培养皿中。加入一毫升浓度为 50 微克/毫升的二次谐波生成纳米颗粒，于 37 摄氏度孵育 30 分钟，以进行非线性光学成像。

将标记的 HEBs 或心脏跳动簇转移至成像室后，使用白光照明下的宽场成像来识别分化 EBS 中或活跃跳动簇内的目标结构。进行快速低分辨率的三维扫描，以重建心脏簇的整体形态，并在簇体积内选择一个包含多个可见二次谐波生成纳米颗粒的成像平面，用于实时监测。心脏簇的收缩使显微镜光学扫描仪处于最快模式，从而实现每秒多次的二维图像采集。

在评估搏动活性之前，按照此处演示的文本方案，使用 MATLAB 软件分析图像。通过表征聚四氟乙烯（PTFE）滤膜的非线性光学响应，确保裸基底产生的光子荧光极弱，不会干扰相关生物样本及孤立颗粒发射光的测量。通过基底以倒置检测模式成像，可轻松获取二次谐波生成的纳米颗粒信号。

在该图像中，二次谐波生成纳米颗粒标记的心脏结构和 EBS 显示为刀片状。红色、黄色和绿色对应 NADH 的自发荧光，而强烈的蓝色二次谐波信号来自分离的二次谐波生成纳米颗粒。请注意，与量子点或上转换纳米颗粒相比，其具有良好的光学对比度和相对稀疏的标记特性。

该图展示了一个由二次谐波生成纳米颗粒标记的心脏搏动簇的切片视图。如本视频所示，以高速记录三维结构，以监测第二个细胞的收缩模式。二次谐波生成纳米颗粒发生聚集，以保持高采集速度，从而解析纳米颗粒的运动。

总体采集灵敏度不足以记录细胞自发荧光与二次谐波产生过程中的二次谐波发射信号。对视频帧进行的纳米颗粒图像分析表明，在同一心脏簇内，位移幅度在数微米量级，且纳米颗粒在二次谐波产生过程中平面内和平面外运动的频率保持恒定。熟练掌握细胞制备技术后，若操作得当，最佳簇解剖、气液培养以及取样可在24至36小时内完成。

尤其是采用此技术时，必须避免开放空气接触，以防止污染。通过此操作流程，还可应用其他方法，例如使用多电极阵列进行电生理记录，以回答更多问题，如将动作电位特征与三维环境中的搏动频率相关联。我们基于谐波纳米粒子检测非线性信号的新型技术，可进一步发展用于活体研究，因为成像所用的波长可实现对组织更深层的穿透。

一个可能的发展方向是利用干细胞衍生结构进行再生医学应用的研究。