用于无干扰微/纳米颗粒细胞工程的微流控缓冲液置换
2016年7月10日
本方案描述了一种基于惯性微流控的缓冲液置换策略，用于纯化经微/纳米颗粒工程化的细胞，并高效去除未结合的颗粒。
本实验的总体目标是展示一种便捷、高效且高通量的微流控纯化技术，用于在纳米颗粒对细胞进行工程化处理后，将游离的纳米颗粒与细胞分离开来。该技术的主要优势在于能够在细胞负载纳米颗粒的操作步骤完成后，快速高效地去除未结合的纳米颗粒。在完成细胞负载操作后，我们收集全部的悬浮液。该微流控细胞纯化技术利用细胞与纳米颗粒在螺旋微流控芯片中所表现出的不同惯性聚焦效应，实现基于尺寸差异的高效分离。
该技术每毫浓度可处理多达一千万个细胞，对于再生医学以及大体积细胞处理非常有用。该技术在细胞工程领域备受青睐，常利用纳米颗粒对细胞进行标记，以实现成像或功能调控。本次实验操作将由我实验室的研究助理邰慧敏以及奚教授实验室的博士后研究员David Yeo博士进行演示。
在六孔板中培养间充质干细胞，使其融合度超过80%，然后用纳米颗粒标记细胞。同样，将THP-1细胞培养至密度为每毫升一百万个细胞。接下来，将一毫克二氧化硅纳米颗粒溶于一毫升200 µM的钙染料溶液中。
将颗粒搅拌过夜。同时，采用此处所示参考文献中描述的方法制备PLGA钙AM纳米颗粒。取1毫克PLGA钙AM纳米颗粒或150微克钙硅酸盐纳米颗粒，加入0.1%聚-L-赖氨酸水溶液中，通过移液器上下吹打溶液1分钟使其混匀。
然后在室温下孵育15至20分钟。接着离心纳米颗粒，弃去多余的聚-L-赖氨酸上清液，并将纳米颗粒重悬于1毫升适用于待标记细胞类型的适当培养基中。
每百万个培养细胞中加入1毫克标记的纳米颗粒至1毫升培养基中。将细胞、纳米颗粒和培养基的混合物用移液器充分吹打混匀1分钟，然后将混合物孵育约24小时。
标记完成后，消化并收集干细胞，重悬于浓度为每毫升100,000至1,000,000个细胞的溶液中，用于微流控处理。标记的THP-1细胞也以相同浓度使用。为制备微流控螺旋装置，首先采用标准的微加工技术制备硅胶晶圆主模具。
然后，将30克基础PDMS预聚物与3克固化剂在称量皿中充分混合。将混合物置于真空条件下脱气60分钟，以去除其中的任何气泡。小心地将PDMS混合物倒入具有螺旋通道图案的主模具中，厚度控制在5至10毫米。
然后将混合物脱气 60 分钟，以去除所有气泡。重复此步骤，直至所有气泡完全消除。接着，将晶圆放入烘箱中，并确保在固化过程中晶圆不发生倾斜，以保证器件高度一致。
在 80 摄氏度下固化 PDMS 两小时。冷却后，使用解剖刀切割出 PDMS 螺旋装置，并小心地将 PDMS 块从母模上剥离。然后，使用解剖刀修整装置边缘，以确保表面光滑，便于键合。
接下来，使用1.5毫米活检打孔器制备两个入口孔和两个出口孔。用异丙醇清洗装置以去除任何碎屑，并将装置置于80°C烘箱中干燥5分钟。
然后，使用遮蔽胶带清洁PDMS装置的底面以及一张玻璃片的一侧。将玻璃片和PDMS装置小心地放入等离子体腔室中，使清洁过的表面朝上暴露。打开等离子体电源至最大功率，降低腔室压力直至腔室呈现粉红色，并将组件暴露处理60秒。
然后，从腔室中取出载玻片和PDMS装置，并通过将经等离子处理的表面紧密压合在一起使其键合。确保两个表面之间无气泡残留。
将键合好的装置置于设定为 80 摄氏度的加热板上加热两小时，以增强键合强度。截取两段长度为 15 至 20 厘米的管路作为入口管，每根管的一端连接一根 23 号针头。然后，再截取两段长度为 5 至 10 厘米的相同管路作为出口管，并将其连接至装置的出口孔。
在运行样品之前，使用装有70%乙醇的注射器手动引液，直至乙醇从出口管路流出。让乙醇在装置中停留至少30秒以进行灭菌。然后，将30毫升含1% BSA的过滤PBS加入60毫升注射器中。
此外，将三毫升标记好的细胞加入三毫升注射器中，并检查两个注射器内均无气泡残留。通过轻轻推出喷嘴处的几滴液体来排除任何气泡。将进样端的注射器接头和管路连接到注射器上，并将注射器固定到注射泵上。
将试管插入装置对应的入口中，并确保管路中无气泡。完成流体系统设置后，将装置固定在倒置相差显微镜上，以便在细胞分选过程中进行实时成像。在显微镜载物台上靠近装置的位置，固定一个小的废液杯和两个15毫升离心管。
将设备两个出口的出液管均放入废液杯中。接下来，通过将样品注射器的流速设置为120微升/分钟，鞘液注射器的流速设置为1,200微升/分钟，使样品与鞘液缓冲液的流速比为1:10。运行设备1.5分钟，使流速有足够时间达到稳定。
使用高速相机在明场相差条件下确认细胞在通道内壁附近发生惯性聚焦的现象。当达到稳态流动且装置正常运行后，将出口管路置于不同的离心管中，分别收集细胞出口和废液出口的洗脱液。该装置能够有效地将标记的THP-1单核细胞悬浮液与荧光二氧化硅纳米颗粒分离开。
通过高速成像和流式细胞术分析均证实，获得了高分离效率。该单步纯化策略能够连续回收标记的悬浮细胞以及重新悬浮于新鲜缓冲液中的贴壁细胞，无需离心步骤。该装置对二氧化硅和PLGA纳米颗粒均能实现高效分离，并可在相同高效率下分离高达每毫升1000万个细胞。
观看本视频后，您应能充分理解如何使用纳米颗粒对细胞进行标记，以及如何利用我们专门设计的微流控装置去除未结合的过量颗粒，从而实现标记细胞的纯化。
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概述
本方案描述了一种微流控纯化技术，旨在高效分离工程化细胞中的游离纳米颗粒。该方法利用惯性微流控实现基于尺寸的分离，在再生医学中具有重要应用价值。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控
- 细胞工程
- 纳米颗粒纯化
背景
- 细胞工程通常涉及使用纳米颗粒。
- 有效去除未结合的纳米颗粒对于获得准确结果至关重要。
- 该技术可实现细胞的高通量处理。
- 其可处理的细胞浓度高达每毫升1000万个。
研究目的
- 展示一种便捷高效的纯化方法。
- 提高工程化细胞与未结合纳米颗粒的分离效果。
- 推动再生医学领域的进步。
使用的方法
- 基于尺寸分离的惯性微流控技术。
- 用于差异性惯性聚焦的螺旋微装置。
- 高通量处理能力。
- 由附属实验室科研人员进行演示。
主要结果
- 成功从游离纳米颗粒中纯化出工程化细胞。
- 在处理大体积细胞样本方面表现出高效性。
- 验证了微流控技术的有效性。
- 在再生医学和细胞工程领域具有潜在应用价值。
结论
- 微流控纯化方法高效且有效。
- 该技术可显著促进细胞工程应用。
- 未来的研究可能会将其应用扩展到各种生物医学领域。
常见问题
行业应用价值
细胞标记后残留的游离纳米颗粒会引入背景噪声和脱靶效应，从而影响基于纳米颗粒的细胞工程工作流程中的数据完整性和治疗安全性。该微流控缓冲液置换策略可实现标记细胞与游离纳米颗粒的高通量、基于尺寸的分离，支持在再生医学和细胞治疗开发中的无干扰应用。该方法解决了关键的纯化瓶颈问题，提高了下游功能检测和成像应用的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过去除未结合颗粒的干扰信号，实现对纳米颗粒标记细胞的功能验证。
- 操作价值：提供一种无需离心的快速纯化工程化细胞群体的方法。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：在新鲜缓冲液中提供纯化的细胞悬液，用于表型和功能筛选，获得一致且低噪声的检测结果。
- 操作价值：支持每分钟106个细胞的高通量处理，可实现大规模研究的可扩展性检测制备。
转化与临床前研究
- 科学价值：在纯化过程中保持基因编辑的 THP-1 和 MSCs 的表型完整性，支持可靠的临床前评估。
- 操作价值：通过提供无干扰的细胞产品用于生物分布和功效研究，促进从发现阶段向临床前工作流程的过渡。
流程与工作流整合
该方法适用于纳米颗粒细胞工程工作流程中标记后、分析前的环节，可实现向功能验证、成像或治疗测试阶段的平稳过渡。
- 发现生物学：通过消除可能掩盖真实细胞反应的纳米颗粒背景信号，支持假设验证。
- 筛选：通过可重复地去除未结合的二氧化硅和PLGA纳米颗粒（>95% 去除率），确保检测体系的就绪状态。
- 分析：减少游离染料或载染料纳米颗粒带来的假阳性信号，实现定量流式细胞术和成像分析。
- 转化研究：将细胞置于适合体内示踪或机制研究的新鲜缓冲液中，促进研究连续性。
- 企业级复用：可重复使用的螺旋微流控装置设计，支持不同细胞类型和纳米颗粒配方间的标准化操作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过最大限度减少纳米颗粒对邻近非靶细胞的干扰，降低机制研究中的不确定性。
- 操作价值：单步操作即可实现超过90%的细胞回收率和超过95%的纳米颗粒去除率，提升实验流程效率。
- 战略价值：通过实现高通量处理而无需多次离心，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：通过提高先导化合物识别和候选物筛选中数据的可靠性，支持基于风险调整的项目推进。
实施注意事项
- 需要具备微流控器件制备与操作的专业知识，包括PDMS键合和注射泵设置。
- 依赖于螺旋微通道制备工具以及高速成像设备，用于结果验证。
- 为实现可重复的分离效果，各研究团队需统一设定流速参数（样品与鞘液流速比为1:10）。
- 若处理不同尺寸的细胞或除二氧化硅和PLGA以外的其他类型纳米颗粒，可能需要对方法进行相应调整。
- 实际应用中的局限性：当细胞浓度过高或存在细胞聚集体时，存在装置堵塞风险，需进行预过滤处理。
