通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与主要免疫细胞亚群的相互作用

本实验的总体目标是通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与主要免疫细胞亚群之间的相互作用。首先将目标细胞与纳米颗粒共同孵育，随后用针对细胞特异性表面标志物的抗体对细胞进行标记，最后通过流式细胞术进行分析。

最终，可以测量纳米颗粒与单个免疫细胞群体之间的相互作用。该技术相较于显微镜等现有方法的主要优势在于，能够对由纳米颗粒引起的非黏附细胞群体中荧光强度的变化进行定量分析。对于纳米颗粒在血液白细胞或纯化单核细胞中的内化作用，首先将目标细胞以每孔1毫升的体积接种于12孔板中，每孔细胞数量为5 × 10⁵。

然后向每个实验孔中加入10 µL新配制的工作浓度荧光二氧化硅纳米颗粒悬液，同时向未处理的对照孔中加入等体积的完全培养基。在37 °C孵育1小时以促进内化后，将样品转移至各自的1.5 mL聚丙烯管中，于室温下以6,000 × g离心3分钟。随后通过蓝色孵育步骤对细胞进行CD14染色：将每种细胞悬液100 µL与10 µL人源抗体按1:11的比例加入运行缓冲液中，于4 °C孵育10分钟。用1 mL运行缓冲液洗去未结合的抗体后，将细胞重悬于200 µL新鲜运行缓冲液中，用于流式细胞术分析。

接下来，为了设置光谱溢出补偿，在流式细胞术软件中打开仪器设置框，然后以低流速获取一个未标记抗体且不含纳米颗粒的样本。在存在荧光纳米颗粒的情况下调整补偿设置是该实验流程中最困难的部分，因为纳米颗粒可能干扰侧向散射。为确保成功，必须手动定义目标细胞群的门控。通过调节电压通道，手动调整前向散射和侧向散射，然后在目标细胞群周围绘制一个适当大小的门控区域。

加载另一个未标记的样本，并在仪器设置框中打开补偿选项卡。在采集过程中调整补偿系数，直到溢出通道中荧光染料阳性与阴性细胞群的荧光强度大致相同。最后，在针对每种单染荧光染料对照管完成补偿调节后，读取纳米颗粒处理的样本，以进一步表征白细胞对纳米颗粒的响应行为；如上所述，进行了细胞内化实验。

例如，在本项代表性实验中，经PBMC分离后，通过前向散射和侧向散射可清晰识别出三种主要的血液白细胞亚群。此外，在经fz二氧化硅处理后，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表现出不同的纳米颗粒内化速率，其荧光强度反映了这一差异。在这些图像中，纳米颗粒内化现象显示于从PBMC中分离的原代CD14阳性单核细胞中。

这些散点图显示了在存在Fitz的二氧化硅纳米颗粒的情况下，CD14阳性单核细胞的情况。直方图展示了以荧光强度表示的Fitzy阳性细胞的定量结果。类似地，还对TP1单核细胞进行了内化实验，用逐渐增加浓度的Fitz的二氧化硅纳米颗粒处理，并以未处理细胞作为阴性对照。

点图显示，在TP一细胞系中，纳米颗粒内化后侧向散射随剂量增加而增强，而前向散射保持不变。这些图谱的数据表明，使用Fitz的二氧化硅纳米颗粒处理可诱导单核细胞呈剂量依赖性内化，表现为细胞内颗粒度增强。为了进一步了解免疫细胞与纳米颗粒之间的相互作用，将小胶质细胞在体外培养七天，并与纳米颗粒共孵育一小时。荧光显微镜结果显示为混合的原代胶质细胞培养物，其中含有大量GFP阴性、非贴壁的星形胶质细胞以及少量GFP阳性细胞。

在此代表性实验中，通过流式细胞术结合单一CD11b抗体染色，可区分出三种胶质细胞亚群：CD11b阴性GFP阴性星形胶质细胞及其他胶质细胞、CD11b阳性GFP阴性小胶质细胞，以及CD11b阳性GFP阳性亚群。后两种亚群能够内化纳米颗粒，其中GFP阳性群体的内化能力略有增强。纳米颗粒的内化可通过共聚焦显微镜进一步验证，本图所示为使用棒状二氧化硅纳米颗粒的结果。

在进行该实验操作时，需要注意将样品避光保存，以防止荧光染料发生漂白，并在抗体孵育过程中将样品保持在4摄氏度。完成该步骤后，可进一步采用共聚焦显微镜等其他方法，以研究纳米颗粒在细胞内的定位等更多相关问题。