利用多光谱成像流式细胞术分析纳米颗粒与细菌的细胞内化作用

通过多光谱成像流式细胞术分析纳米颗粒和细菌被细胞内化的细胞机制。首先用细胞松弛素D预处理巨噬细胞以抑制肌动蛋白聚合，然后将纳米颗粒或沙门氏菌加入巨噬细胞单层中并进行孵育。

然后收集巨噬细胞，固定并标记，用于成像流式细胞仪分析。通过多光谱成像流式细胞术，可区分已摄取纳米颗粒和/或沙门氏菌的细胞与仅在表面结合纳米颗粒和/或沙门氏菌的细胞。结果数据显示，只有未经细胞松弛素处理的细胞才会内化沙门氏菌和纳米颗粒。

这表明内化作用依赖于肌动蛋白。该技术相较于流式细胞术和共聚焦显微镜等现有方法具有多项优势。其主要优点在于能够以高速度精确测量不同细胞特征之间的荧光信号强度及空间分辨率。

该方法有助于解答生物材料疫苗和药物递送研究以及病原体与宿主相互作用研究中的关键问题，包括阐明聚酸酐纳米颗粒和细菌所利用的内化途径。通常，初次接触该方法的研究人员常常会遇到困难。

为了获得最佳的荧光信号，花时间对染料进行滴定非常重要。此外，熟悉软件并创建分析模板也需要时间。当我们发现聚合物纳米颗粒在使用显微镜及其他技术时表现出类似病原体的特性，我们首次提出了该方法的构想。

随后，我们希望在进行检测之前，建立一种高通量系统，用于比较沙门氏菌与花粉氢化纳米颗粒所利用的内化过程。所有哺乳动物细胞和细菌培养物均应进行收获，纳米颗粒悬浮液也应提前制备。首先使用细胞刮刀收获融合生长的 RAW264.7 细胞。

使用血细胞计数板确定细胞数量。然后将细胞以每孔5 × 10⁵个细胞的密度接种于24孔培养板中，每孔体积为0.5 mL。加入完全DMEM培养基，在37°C、5% CO₂培养箱中孵育过夜。

为了制备沙门氏菌 Tarica 稀释液，将沙门氏菌转入 C-D-M-E-M 培养基中，使感染复数达到每 RA W2 64.7 细胞一百个，在 16 × 125 毫米带螺帽的玻璃培养管中进行。接下来，使用无菌称量纸，在 1.5 毫升微量离心管中准确称取五毫克 1%FITC 负载的聚酸酐纳米颗粒，该纳米颗粒的制备方法参照 Rean 同事在 2009 年发表于《制药研究》（Pharmaceutical Research）的文章所述。将纳米颗粒加入 0.5 毫升预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并置于冰上。

将离心管保持在冰上。使用带微探头的超声波液体处理器，在每秒4至6焦耳的功率下超声处理悬浮液约25秒。现在所有所需的细胞和试剂均已准备就绪，可以进行吞噬作用检测实验。

在第一块培养板上标记含有培养的 RAW264.7 细胞的 24 孔组织培养板，以准备进行检测。以下每种样品均需设三个重复孔：含纳米颗粒的细胞松驰素 D、含沙门氏菌的细胞松驰素 D、仅含纳米颗粒的培养基、含沙门氏菌的培养基、仅含沙门氏菌、以及仅含 AF647 染色细胞的对照组。第二块培养板用于设置 4 °C 对照组，包括含纳米颗粒的培养基和含沙门氏菌的培养基，在低温条件下孵育，以减缓吞噬作用等细胞过程。在诱导前一小时，向相应的孔中加入 5 µg/mL 的细胞松驰素 D 和 C-D-M-E-M，并将细胞在 37 °C 下孵育。

孵育结束后，涡旋纳米颗粒悬浮液，并取10微升加入相应的孔中。然后涡旋沙门氏菌，并以MOI为100的感染比例加入相应的孔中。轻轻敲击培养板数次以混匀。

然后将样品板置于37摄氏度，阴性对照板置于4摄氏度，孵育45分钟。孵育结束后，将板置于冰上，用预冷的不含钙和镁的PBS洗涤细胞两次，通过抽吸并弃去旧培养基以去除未结合的颗粒、沙门氏菌以及死亡或脱落的细胞。使用花瓣镁。

在此阶段预先使用 PBS 至关重要，因为它有助于细胞从基质上脱离。为了收集细胞，加入 250 微升冰冻 PBS，轻轻刮取孔板中的细胞，将收集的细胞转移至经硅化处理的带盖微量离心管中，并置于冰上。通过加入 1 毫升冷洗涤缓冲液洗涤细胞，然后在 4 摄氏度下以 250 × g 离心 10 分钟。弃去上清液后，将倒置的微量离心管轻敲在纸面上以去除残留缓冲液。

用移液枪轻轻刮擦微型离心管底部，使细胞沉淀重悬于液体中。固定细胞时，加入 100 微升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，室温下静置 15 分钟。随后加入 1 毫升透化洗涤缓冲液洗涤细胞，在 4 摄氏度下以 250 × g 离心 10 分钟。

弃去上清液后，按先前步骤去除残留缓冲液。然后对RA W264.7细胞进行染色。对于肌动蛋白染色，加入含有Alexa Fluor 647的100微升破膜洗涤缓冲液，孵育15分钟。

在室温下，未染色的样品应使用破膜剂（perm）孵育，并用不含phin的洗涤缓冲液洗涤。染色后，再次洗涤并离心细胞，然后将细胞重悬于50 µL含有1% PFA的PBS中，置于4°C避光保存，直至上机检测。启动电源，进入成像流式系统并开始运行。

在文件菜单中激发并初始化流体系统。选择加载默认模板。在图像库中，于查看菜单选择全部，必要时按运行设置以开始对微珠成像，如有需要，调整核心追踪以使图像在横向居中。

选择明场通道并点击设置强度。等待流速变异系数持续低于0.2%。在辅助选项卡中，点击启动全部以运行校准和测试，并在软件中确认所有项目均已通过。点击加载样本。

然后根据指示，将含有最亮样本的样品管放入。在样本加载器中使用所有荧光染料时，选择40倍放大倍数。仪器参数设定后，整个实验过程中不得再更改。

通过点击软件中的激光器图标，开启实验中每一路激光，并调节激光功率，使每种荧光染料在散点图中测得的最大像素值介于104,000计数之间。为排除非目标物体的采集，点击软件中的细胞分类窗口。随后，为仅采集细胞数据，在明场的第一通道中设置面积下限，并将阈值设为50微米；面积小于50微米的物体将被视为碎片，不予采集。

通过点击软件中相应的通道图标来选择要采集的通道。在设置选项卡下，已选择通道 1、2、3、4、5 和 6。输入文件编号和目标文件夹。

将序列号设置为1，采集事件数设置为5,000。点击运行，开始采集并保存第一个实验数据文件。点击FLL，运行下一个实验样品。

重复上述步骤，直至收集完所有实验样本。接下来，为运行对照，单击补偿设置（comp settings）。这将关闭明场和散射激光，并在“采集”选项卡下启用所有荧光通道的采集。

将输入值更改为500。然后放置对照管并点击运行。采集单染对照样本中的500个阳性细胞。

针对实验中的每种荧光染料重复此步骤，以建立补偿矩阵。所有样本图像采集完成后，通过双击桌面 ideas 图标，在独立的分析计算机上启动 ideas 分析软件。双击“内化向导”（internalization wizard），并加载一个测试样本的 RIF 文件。

弹出窗口将提供加载测试文件的说明。请按照说明操作，然后点击下一步按钮。接下来，点击新建矩阵。

这将启动补偿向导。当系统提示时，选择单色对照的数据文件以添加它们。按照向导中的说明点击“下一步”，直至在内化向导的第二步中保存补偿矩阵文件并将其加载到对应框中。

单击下一步并按照指示操作，直到生成 DAF 文件。通过选择采集过程中使用的图像通道来设置图像显示属性。选择通道二用于 FITC，通道五用于 AF606。

明场和侧向散射默认被选中。选择明场通道O1以确定细胞边界，选择通道O2（其中收集了纳米颗粒或细菌用于内化探针）以定义单细胞群体，系统将生成所有细胞的明场面积与明场长宽比的散点图。高通量分析多个数据文件需要模板文件，因此在创建模板文件时仔细设定门限至关重要。

每个点代表单个细胞图像的数值。单击图表中的一个点，可在图像库中选择该特定细胞的图像。

接下来，根据对应单细胞事件的面积和长宽比，在细胞周围绘制门控。单细胞的长宽比约为1，而双联体的长宽比约为0.5。

点击多个细胞，以区分包含单个细胞的区域与双联体或碎片区域。生成明场图像的明场梯度均方根直方图。点击下一个按钮。

然后在“群体”选项卡下，选择“箱选”选项以显示选定的箱体。点击各个箱体以确定细胞位置和最佳焦平面。开始绘制一条线区域以追踪聚焦的细胞。

梯度RMS值越高，聚焦效果越好，除非还需根据其他染色进行设门，否则跳过下一步。生成一张新的散点图，横轴为第二通道的强度，纵轴为第二通道的最大像素值。点击散点并查看对应图像，以帮助确定围绕纳米颗粒或细菌阳性细胞的设门区域。

通过生成一个从零开始的区域来绘制内化特征的直方图，该区域应通过观察图像进行调整。内化特征是细胞内部荧光强度与整个细胞荧光强度的比值。该比值经过标准化处理，当其值为零时，表示一半的荧光强度位于细胞内部。

向导通过生成一个掩膜来确定每个细胞的内部区域，该掩膜以细胞图像作为输入以识别细胞表面，并将该表面向内腐蚀四个像素。请注意，必要时可根据不同细胞类型，在明场图像上先创建一个对象掩膜，再通过更多或更少的像素进行腐蚀，从而手动调整此掩膜。内部化特征由软件中的算法基于此腐蚀后的对象掩膜计算得出。

此功能可帮助我们区分已内化的颗粒和细菌（其大部分荧光信号位于掩膜边界内）与表面结合的颗粒和细菌（其大部分荧光信号位于掩膜边界外），如本示例所示。基于腐蚀后的对象掩膜创建一个新的包含内化特征的直方图。通过在选定的分箱模式下查看图像，绘制区域以对内化细胞设门。将门设为 0.3。此处。

评分低于 0.3 的细胞被视为表面结合颗粒阳性的细胞。为了排除背景标记的细胞，并识别特异性内化的纳米颗粒或细菌，请从分析菜单中选择特征。单击分析菜单。

然后单击“添加”旁边的斑点计数功能，将平均斑点数添加到统计报告中。在报告菜单中，单击报告图标，然后定义统计报告，接着添加列，最后选择相应的细胞群体。

单击“确定”。内部化向导将自动向此报告添加统计信息，以便将数据文件保存为模板文件，用于批量分析所有实验文件。单击文件菜单，然后选择“另存为模板”。

模板文件。在 Idea 软件中使用扩展名为 dot AST 的文件来分析多个数据文件。点击工具，选择批量数据文件，并输入所有 RIF 文件。

在相应区域添加补偿矩阵文件和模板文件以提交批次进行处理，然后点击提交。处理步骤完成后，所有RAF文件将被分析，并为每个原始文件生成对应的DAF文件。系统将生成一份最终报告，其中包含所有样本的统计结果，用于比较肌动蛋白抑制和低温对沙门氏菌及纳米颗粒吞噬作用的影响。

RA W2 64.7 细胞在 37 摄氏度的培养基中孵育，孵育时培养基中或含有或不含细胞松弛素 D，或在 4 摄氏度的培养基中孵育。温度变化和肌动蛋白的干预均减少了纳米颗粒和沙门氏菌的内化作用。然而，用细胞松弛素 D 孵育细胞会增加表面结合纳米颗粒的细胞百分比，同时降低表面结合沙门氏菌的细胞百分比。

表面结合纳米颗粒的细胞比例在37摄氏度时约为8%，经细胞松弛素D处理或在4摄氏度处理后，上升至超过35%。相比之下，经细胞松弛素D处理后，表面结合沙门氏菌的细胞比例从35%下降至15%。将RAW264.7细胞在4摄氏度下与沙门氏菌共孵育，可减少细菌的内化，且与37摄氏度对照组相比，表面结合细菌的数量无明显增加。综上，这些数据表明沙门氏菌和纳米颗粒通过一种相似的细胞过程被内化，该过程依赖于肌动蛋白且具有温度依赖性。

此外，数据表明，沙门氏菌持续黏附于巨噬细胞需要肌动蛋白聚合。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用多光谱成像流式细胞术检测纳米颗粒和细菌的细胞内化过程。在进行该实验操作时，需牢记抑制剂具有细胞毒性。

因此，有必要先进行细胞毒性预实验，以确定使用的最佳浓度。请注意，操作沙门氏菌可能存在危险，执行本实验时应采取相应的预防措施，例如穿戴适当的个人防护装备，并避免产生气溶胶。