发育中胚胎小鼠心脏的细胞标记与注射

本实验的总体目标是对小鼠胚胎心脏进行细胞、染料或DNA的注射。为了研究细胞命运或实现基因表达的局部操控，首先从怀孕小鼠体内解剖出胚胎并暴露其心脏，随后将DNA、染料或细胞注射至心脏中特定的目标区域。

随后，在胚胎孵育后，取出心脏并进行体外培养。最后，通过显微镜观察确定注射或标记细胞的命运。最终，利用共聚焦显微镜或明场及落射荧光显微镜监测注射、标记或基因修饰细胞的命运，揭示特定基因和细胞在心脏发育过程中的功能重要性。

与现有的小鼠转基因等方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够将实验室培养或基因修饰的细胞在体内进行局部且精确地注射。这使得我们可以在合适的微环境中对这些细胞进行研究。接下来将由我以及来自实验室的博士研究生 Emily Aar 演示该实验操作。

在准备仪器、试剂和溶液后，根据文本方案，从安乐死的怀孕小鼠中收集 E 9.5 和 E 10.5 胚胎：首先使用 70% 乙醇对胸部进行消毒，沿腹中线做切口打开腹腔，取出子宫角，然后将其转移至室温 PBS 中。在 PBS 中再清洗两次后，将其转移至盛有硅胶的培养皿中。使用 M 16 培养基，用昆虫针将子宫角固定在硅胶层上，使子宫的血管化面朝下。

然后使用精细镊子切开子宫表面，并在表面以下一毫米处切除蜕膜。展开蜕膜壁，轻轻取出卵黄囊中的胚胎。在进行细胞注射前，将其保存于37摄氏度的M16培养基中以备注射。

首先，使用 Hamilton 注射器从后端向玻璃移液管中加入 DNA 或细胞，并轻轻振荡移液管以去除气泡。然后将移液管尖端安装到显微注射仪的持针器上，并根据以下参数设置注射仪。接着，通过卵黄囊将胚胎固定在硅胶底部，注意不要触碰胚胎本体。

然后确定心脏区域，并在该区域上方小心切开心包膜。在胚胎周围插入四枚固定针，以防止细胞注射过程中发生移动。将显微操作仪设为手动模式，缓慢调节移液器尖端，使其位于心包上方约45度角的位置，正对需要注射的心脏区域上方。

将移液器移至目标区域，触发注射并尽快取出移液器。在DNA或细胞注射后，确保心脏正常跳动。使用本视频中所述的注射方案来研究上皮向间充质的转化过程，在E 9.5时期，向房室管（A VC）外植体注射了一种S-H-R-N-A，该分子可下调内膜细胞内皮-间充质转化所必需的一种蛋白质。对照胚胎则注射了空骨架载体。同样，在E 10.5时期，将HUES细胞来源的内皮前瓣膜细胞（在SOX九启动子调控下表达GFP）注射到房室管中，随后进行48小时的外植心脏培养。

这些细胞获得了类似于内源性心内膜细胞的上皮-间质转化（EMT）标志物，例如periostin。本文所示的离体方法相对简单，但仅限于最长48至72小时的短期随访。然而，文本方案中描述的超声引导注射操作虽然在技术上更具挑战性，却能够实现长期甚至出生后的宫内随访。

本文展示了通过子宫内注射染料或病毒载体来标记特定心脏区域细胞的方法。利用该方法，可使用荧光染料或病毒特异性地标记心外膜细胞，并可通过引入其他细胞或替代性注射物质对该技术进行拓展。完成该操作后，可进一步进行胚胎培养等后续实验，以探究基因、分子的长期效应，或发育后组织形态发生等长期生物学过程的读出结果。

该技术为心脏发育生物学与遗传学领域的研究人员开辟了道路。它使我们能够探索新基因的世界，同时在适当的胚胎环境中研究人类细胞命运。当无法获得转基因小鼠品系时，这一方法尤为有用。