小鼠胚胎心脏中心肌细胞发育的免疫荧光分析

本实验的总体目标是评估发育中胚胎小鼠心脏的肌纤维和心肌细胞成熟度。首先将胚胎心脏在包埋介质中定向并冷冻，然后以正确的方向进行冷冻切片，从而实现这一目标。

然后对心脏切片进行目的蛋白的免疫荧光标记。最后，对免疫染色的心脏切片进行共聚焦显微镜观察。最终，通过二维和三维图像分析来展示肌成纤维细胞（MyFi）及其他心肌细胞结构的发育过程。

该方法有助于回答心脏发育领域的关键问题，例如突变和心脏基因如何影响肌纤维的组装以及特定结构（如闰盘和横小管）的形成。为快速冷冻胚胎心脏，需在化学通风橱中使用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充一个3.5厘米的培养皿。将异戊烷置于液氮中冷却。

根据文本方案分离小鼠胚胎心脏后，将心脏置于OCT包埋剂中，静置数秒使其平衡，然后转移至含有OCT包埋剂的7毫米模具中。将心脏的内壁朝下放置于模具底部。轻轻将模具放入液氮冷却的异戊烷中。

注意避免使异戊烷液体与 OCT 包埋剂或心脏组织接触，直至 OCT 呈现均匀的乳白色固体状态。随后将模具转移至装有干冰的冰桶中。待所有心脏组织完全冻结后，用铝箔包裹冷冻模具，并于 -80 °C 保存，直至进行冷冻切片。

为了固定胚胎心脏，使用含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）填充12孔培养板的各孔。根据文本方案解剖获取胚胎心脏后，将每颗心脏放入一个含有PFA的孔中，并在4°C条件下过夜固定。为进行冷冻保护，使用塑料移液器将每颗心脏转移至含有1.5毫升15%蔗糖（Sucrose）PBS溶液的1.5毫升微量离心管中，在4°C条件下轻轻振荡，直至心脏沉至管底。随后将每颗心脏转移至含30%蔗糖PBS溶液的管中，同样在4°C条件下轻轻振荡，直至心脏完全沉降至管底。

按照本视频前面演示的方法，将胚胎在OCT中冷冻。将冷冻模具放入冷冻切片机腔室并平衡至-17°C后，将冷冻模具倒置，轻轻施压，使心脏组织块从模具中脱出。将心脏的前壁朝上，调整其方向，使其位于成型的组织块顶部。

在样品夹头上滴加一大滴OCT包埋剂，将心脏组织块置于OCT液滴上。保持心脏前壁远离样品夹头的方向进行定位。让心脏组织在样品夹头上冻结固定。

将夹头和固定好的心脏组织块装入冷冻切片机的样本架上。调整角度，使刀片与样本之间的夹角为三到五度。将厚度为10 µm的切片收集到经正电荷涂层预处理过的显微镜载玻片上。

在将样本储存于负80摄氏度以进行免疫荧光检测之前，需确保样本完全干燥。对切片进行固定和/或去除OCT后，使用一倍浓度的封闭缓冲液（以PBS稀释）在温和振荡条件下封闭45分钟。若使用小鼠来源的一抗，需加入驴或山羊抗小鼠IgG H+L单价Fab片段，以含0.1%吐温20的PBS按1:100比例稀释，室温孵育45分钟，同时保持温和振荡。

加入用一倍封闭缓冲液稀释的一抗或一抗混合物，在室温下孵育两小时，或在4摄氏度下过夜孵育。孵育结束后，用一倍PBS缓冲液洗涤切片三次，每次10分钟。在室温下，向样品中加入用封闭缓冲液按1:500比例稀释的偶联二抗，避光孵育两小时。

室温下，用一倍磷酸盐缓冲液（XPBS）避光洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。封片时，在载玻片两端各加两滴抗荧光淬灭封片剂，然后盖上盖玻片。用指甲油封固盖玻片边缘。

将样品置于 4 °C 避光保存，直至准备成像。使用 4 倍物镜和激光荧光找到样本及目标区域。采集图像用作定位图。

高倍成像时，将载玻片移开，对载物台进行最小限度的调整，然后更换为60倍油浸物镜。

在物镜上滴加一滴浸油，然后将玻片放回载物台。接着重新找到样本，为每个通道设置所需的激光功率、曝光时间和二分之一像素合并（binning）参数。根据文本方案中的指导确定最佳设置后，在整个实验的所有组织切片中均使用相同的样本设置。

使用强度直方图记录每个通道的最佳强度范围，该范围将用于后续分析。通过选择适当的激光通道，利用采集功能生成Zack。然后选择Z层扫描的上限和下限。

选择Zack步进尺寸，其值为软件提供的光学切片厚度的一半。点击运行，使用Fiji或类似的图像分析程序采集图像。使用自定义颜色模式选项打开Zack文件，并将各通道拆分为独立的窗口。

从图像下拉菜单中打开调整亮度对比度工具，并为每个通道设置最佳的直方图强度范围。根据先前确定的参数，将这些通道范围应用于所有待分析的Zacks图像。然后从图像颜色下拉菜单中，将各个通道合并为单一的复合图像。

使用图像堆栈的Z投影菜单，从复合图像创建一个扁平化的Z堆栈。由于该图像将明显比3D图像更亮，因此需调整对照样本的直方图强度范围以避免过饱和，并将相同的设置应用于实验组的扁平化Z堆栈。要生成3D图像，首先选择图像堆栈的3D投影菜单，然后选择X轴或Y轴作为旋转轴。

将切片间距设置为与Z堆栈步长相同的微米数值。选择所需的总旋转角度，并将旋转角度增量设置为1。然后从插件下拉菜单中打开ImageJ 3D查看器。

选择生成的复合图像以体积形式显示，并将重采样因子设置为1或2。这些图像展示了在速冻和丙酮固定的胚胎心脏中对不同蛋白质进行共聚焦染色的典型结果：抗Sα-肌动蛋白抗体可稳定地标记Z线以及闰盘结构，具有高度特异性和极低背景信号。抗黏附连接蛋白β-连环蛋白的抗体结合于心肌细胞和非心肌细胞的细胞膜，与SFA肌动蛋白在E16.5时期的闰盘区域出现共定位。胚胎心脏中β1整合素的免疫荧光染色尤其具有挑战性，但在本研究中，β1整合素染色显示出与SFA肌动蛋白标记的Z线相同的周期性信号，可能反映了在E16.5时期正在形成的新生肌节结构。

在 E 12.5 时期，心室小梁心肌细胞中 SFA 肌动蛋白和原肌球蛋白的染色模式显示出规则的周期性，与外层致密区成熟肌原纤维的特征一致；而 SFA 肌动蛋白的染色呈点状多于线状，原肌球蛋白信号则呈弥散状而非线状。E 12.5 胚胎心脏中 NCA 的黏附性染色与心室小梁心肌细胞区域与强烈 SFA 肌动蛋白染色区域共定位，可能代表闰盘结构。图中显示的是经 PFA 固定的 E 12.5 胚胎心脏，来自 Life Act RFP Ruby 转基因小鼠，标记了 SFA 肌动蛋白和丝状肌动蛋白。与速冻心脏切片相比，其 SFA 肌动蛋白信号与噪声比有所降低。

三维图像重建显示，心肌细胞内的肌原纤维大致相互平行，但不同心肌细胞之间的取向角度各不相同。观看本视频后，您应能够充分理解如何正确地对胚胎心脏进行定向与冷冻切片，以及如何开展免疫染色、共聚焦显微镜观察和图像分析，以评估小鼠心脏发育过程中肌原纤维和心肌细胞的成熟情况。Admit。