A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

该程序的总体目标是研究培养细胞中的代谢谱。这是通过首先从细胞中提取极性代谢物来实现的。第二步是在水中复溶细胞提取物，并将样品转移到 LC 样品瓶中。

接下来，将样品注入 lc QE MS 仪器中，该仪器已经过校准，并在最后一步将原始数据记录在计算机中。使用商业软件从原始数据中提取代谢物峰，并在高分辨率质量数据库中搜索未知峰。虽然这个母版可以深入了解 SARS 中的相对代谢物水平，但它也可以应用于其他系统，例如血清或组织。

首先，用 3% 乙酸铵、丁腈和水制备 500 毫升流动相 A（即 20 毫摩尔乙酸铵）和 15 毫摩尔氢氧化铵。松散地盖上瓶子盖上后，在水浴中对溶液进行超声处理 10 分钟，无需加热。然后将 5 毫克氟乙酸钠和酸溶解在 5 毫升水中，使最终浓度为 1 毫克/毫升。

然后将二嗪农溶解在甲醇中，使最终浓度为 10 μg/mL。要制备 1 mL 负低质量校准溶液，请将 960 μL 热负校准溶液与 20 μL 氟乙酸钠和高香草酸溶液混合。要制备 1 mL 阳性低质量校准溶液，请混合 990 μL 热阳性校准溶液和 10 μL 二嗪农溶液。

在正模式下进行标准质量校准后，在仪器控制面板中将扫描范围调整为 60 至 900 质荷比，并应用 25 电子伏特的源碰撞诱导解离。输入自定义校准离子，离子源稳定后，在调谐页面开始自定义校准。在负模式下进行标准质量校准后，将极性切换到负模式，在仪器控制面板中将扫描范围调整为 60 至 900 质荷比，并应用 35 电子伏特的源碰撞诱导解离。

输入自定义校准离子，一旦离子源稳定，即可开始自定义校准。在调谐页面中，将 QE MS 仪器固定在 C 级，然后将其连接到氮气入口、蒸发器电缆和电压电缆，为 QE MS 仪器配备加热电喷雾电离或 HESI 探头。在 computer tuning 页面中，设置探测器的相关 tuning 参数。

将毛细管温度设置为 320 摄氏度，将 S 镜头设置为 55 摄氏度。接下来，在 method 程序中，使用以下值构建 full scan 方法。通过输入线性梯度信息来建立色谱方法。

在室温下使用 amid 色谱柱进行化合物分离。此时，通过将 40 毫升甲醇和 10 毫升水手动混合到 50 毫升中来制备提取溶剂。二。当先前培养的结肠癌 H CT 8 个细胞达到 80% 汇合时。

快速吸出培养基，并将 6 孔板放在干冰上。然后立即向每个孔中加入 1 毫升提取溶剂，并将板转移到负 80 摄氏度的冰箱中。从冰箱中取出板后，15 分钟后，将其放在干冰上，将细胞刮入溶剂中。

将溶液从每个孔转移到三个 1.7 ml einor 管中，并以 20， 000 倍 G 的速度在 4 摄氏度下离心样品 10 分钟。离心后，将上清液转移到两个新的浓度管中。然后在高速真空中干燥样品。

样品干燥后，将其存放在零下 80 摄氏度的冰箱中。从冰箱中取出样品进行分析后，让它们达到冰温。然后加入 20 微升冰冷水，涡旋样品以溶解代谢物。

接下来，在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 G 离心样品。将 SUPERNAT 转移至 lc 样品瓶中，将 5 μL 样品注入 lc QES 仪器进行分析。在 QE MS 仪器上正确进行校准后，以 0.15 mL/min 的流速用 85% 的流动相 B 平衡液相色谱柱 5 min。

接下来，以随机顺序设置样品序列，以将 LCMS 引入的波动分布到每个样品中，并确保不同样品之间的比较更加准确。每 6 个样品后，添加一次洗涤运行，然后添加一个空白样品，以评估系统背景和残留水平。保存序列并开始序列运行。

当液相色谱柱显示稳定压力接近 400 PSI 时，在序列的前两个样品运行后，检查这些色谱图中的峰中是否存在未知代谢物，以确保样品序列顺利运行。序列中的所有样本完成后，在单独的计算机上执行数据分析。在市售软件上为小分子选择峰对齐和框架提取方法。

然后加载 lc ms 原始数据，并根据样品类型对其进行分组。选择运行序列中间的样品作为色谱参考样品进行峰对齐，并选择一个组作为比率组或完整变化计算。然后上传框架种子，包括用于目标代谢物分析的已知代谢物，以及收集的数据和相应的框架种子。

接下来，选择正或负模式下的全光谱扫描，并将此数据处理文件保存在与原始数据相同的文件夹中。关闭数据库搜索功能并运行工作流。然后将工艺数据导出为包含每帧峰面积的 Excel 工作表。

对于非靶向代谢物分析，请选择组分提取方法。加载样本原始数据和三个空白样本以进行背景扣除。在此组之后，原始数据并如前所述设置参考样本。

将组件阈值设置为 10 到第五个。使用人类代谢组数据库进行未知化合物鉴定。保存此处理文件后，关闭数据库搜索功能并启动工作流。

数据处理完成后，使用变异系数或 CV 过滤器去除重复样品和强度过滤器中 CV 较大的组分。要手动去除在噪音水平下检测到的组分，请仔细检查每个组分，并选择那些在不同样品类型中具有明确峰或差异相对较大的组分进行数据库搜索。最后，导出数据库中具有命中的数据。

代谢组学数据的准确性在很大程度上取决于液相色谱 QEMS 仪器的性能，以评估仪器是否运行良好以及所采用的方法是否正确。从总离子色谱中提取了几种已知的代谢物 lc 峰，如下所示。极性代谢物（包括氨基酸、糖酵解、中间体、TCA、中间体核苷酸、维生素 A TP 和 NADP）在当前液相色谱条件下具有良好的色谱柱保留性和良好的峰形。

同时，如图所示，在低质量校准后 24 小时内进行质量误差测试。在这里，通过将检测到的质荷比与目标代谢物的理论质荷比进行比较来评估质量误差。在这里，目标代谢物的质荷比范围为 74 至 744。

此处的 Y 轴表示特定质量数误差范围内代谢物的累积百分比。蓝色曲线显示校准后 0 至 12 小时的结果，而红色曲线显示校准后 12 至 24 小时收集的数据。超过 90% 的代谢物在质量数误差在 5/100 00范围内，这意味着本文开发的低质量范围校准方法足以保持 5/100 质量数的误差，用于低质量数范围检测。

另一个需要解决的问题是仪器对当前方法和仪器设置的灵敏度。对来自 10 cm 培养皿的一式三份样品进行 5 次连续稀释，稀释倍数为 6，得到 6 种不同浓度的样品。靶向列表用于评估在不同浓度样品中检测到的代谢物数量。

此处显示的结果表明，检测到的目标代谢物的最佳数量在 2.78 乘以 10 到 5 之间，到 6 个细胞的 1.67 乘以 10 到 7 个细胞给出的检测到的代谢物数量较少，这是由于离子抑制效应。该结果表明，用于此分析的最佳细胞量大致是 6 孔板中一个孔的量。对于非靶向代谢物分析，使用 20% 的 CV 截止值和 10 到 7 的平均强度值来过滤组分表。

可以增加 CV 截止值，而需要降低平均强度值以包含更多峰手动检查峰后，选择具有良好形状的组分并在人代谢组数据库中搜索。此处列出了在正模式下收集的数据的结果，而此处列出了负模式下的结果。此处鉴定的一些代谢物与目标列表中的代谢物重叠，例如谷胱甘肽和脯氨酸。

还探讨了靶向列表中不存在的其他代谢物，例如乙二醛甲酯，它可以来自糖酵解和一个 PTO、两个 ELE SN 甘油、三个磷酸胆碱，它在阳性模式下检测到，保留时间为 3.2 分钟。看完这个视频，您应该对如何从培养的 SARS 中提取多代谢物，然后使用 RC QES 测量不同样品中的相对代谢水平有一个很好的了解。感谢您的观看。