使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

与目前使用的酵母代谢组学方法相比，本方案具有多种优势：高特异性、高灵敏度，并且能够对多种不同类别的代谢物进行分析，包括异构体、同量异位体、亲水性和疏水性分子。本方案所采用的淬灭方法可终止所有酶促反应，同时显著减少代谢物从细胞中的泄漏。本方案构建的MS1谱图库来源于多次不同的MS2运行结果。

在30摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养后，测定每毫升培养液中的酵母细胞数量，并向两个锥形瓶中各加入5毫升灭菌的20%葡萄糖储备液，每个锥形瓶中含有45毫升经高压灭菌的YP培养基。使用无菌移液管向每个锥形瓶中加入5×10⁷个酵母细胞，并在30摄氏度、200转/分钟条件下继续培养至少24小时。进行代谢物提取时，培养结束后通过离心收集酵母细胞，并迅速移除上清液。

将离心管置于干冰上，向细胞中加入 2 毫升 -20 摄氏度的氯仿、1 毫升 -20 摄氏度的甲醇、1 毫升冰冻的纳米纯水以及 200 微升 425 至 600 微米经酸洗处理的玻璃珠。加入玻璃珠后，用铝箔包裹离心管，放入带有固定夹的泡沫管架装置中，在 4 摄氏度下以中等速度涡旋振荡 30 分钟，以促进代谢物的提取。随后，将离心管在冰上孵育 15 分钟，然后进行离心，使上层水相与中间的碎片和蛋白质以及下层有机相分离。

使用微量移液器将约 400 微升上层水相转移至已清洗并标记的 1.5 毫升离心管中，该离心管内含有 800 微升 -20 摄氏度的乙腈。然后离心样品，并将上清液上层的 800 微升转移至标记好的质谱小瓶中，在 0 摄氏度下保存，直至进行液相色谱-串联质谱分析。为分离提取的代谢物，先将样品小瓶超声处理 15 分钟，随后在室温下进行三次每次 10 秒的涡旋振荡。

涡旋后，将小瓶放入液相色谱仪的孔板中，设置色谱柱温度为45摄氏度，流速为0.25毫升每分钟，孔板温度为0摄氏度。然后根据表格设定液相色谱梯度用于分析。分离后，在配备加热电喷雾离子源的质谱仪中，分别采用电喷雾离子化正离子和负离子模式，注入10微升样品体积，用于鉴定和定量水溶性代谢物。

分析结束后，在合适的化合物分析软件中打开原始数据，并利用质谱碎片图谱库匹配质谱，以注释分析中鉴定出的代谢物。还可通过鉴定一级质谱（MS1）的精确质量和同位素模式，利用在线数据库对代谢物进行注释。然后使用数据库和谱图库搜索原始数据的二级质谱（MS2）图谱。

第二天，在淬灭酵母细胞后，用15毫升ABC缓冲液彻底洗涤细胞，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于1毫升新鲜ABC缓冲液中，向细胞中加入500微升碘化丙啶溶液。涡旋混匀样品三次，每次10秒，并将细胞置于冰上避光孵育10分钟。

孵育结束后，通过离心收集细胞，并用一毫升新鲜ABC缓冲液洗涤细胞三次，每次洗涤使用一毫升。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于300微升新鲜ABC缓冲液中，取10微升所得细胞悬液加入载玻片。使用荧光显微镜，在激发波长593纳米、发射波长636纳米的滤光片条件下，采集细胞的微分干涉差（DIC）和荧光显微图像。

然后使用适当的图像分析程序，对明场和荧光图像中的细胞进行总细胞数计数，并测定单个细胞染色的荧光强度。改进的细胞淬灭方法对细胞质膜和细胞壁造成的损伤显著低于在负40摄氏度下使用非缓冲80%甲醇的淬灭方法。事实上，几乎所有采用改进方法进行淬灭的细胞均表现出红色荧光发射，这是质膜和细胞壁未受损伤的酵母细胞的典型特征。

相比之下，几乎所有采用在40摄氏度条件下使用非缓冲80%甲醇淬灭的细胞均显示出绿色荧光发射，这是细胞质膜和细胞壁严重受损的酵母细胞的典型特征。与在负40摄氏度条件下使用非缓冲80%甲醇淬灭的方法相比，改进后的细胞淬灭方法导致酵母细胞中水溶性代谢物的泄漏显著减少。与反相色谱柱相比，两性离子相色谱柱的水溶性代谢物标准品的保留时间漂移值显著更低，且峰形明显更尖锐。

液相色谱串联质谱法的另一个优势在于能够使用两性离子相色谱柱，有效分离具有不同结构、物理和化学性质的多种水溶性代谢物。进行碘化丙啶染色时务必避光操作，同时在收集上层相时注意不要扰动中间相。若由于缺乏MS2谱图库而无法对某些MSP进行注释，则可使用核磁共振（NMR）来解析其结构。