近胞体生物胞素标记法用于研究单个皮层神经元的结构-功能关系

本实验的总体目标是将感觉皮层在信息处理过程中特定细胞类型的动作电位放电活动与其所记录神经元的形态学特征联系起来。该目标首先通过外科手术准备大鼠以进行胞体旁记录来实现。手术完成后，使用电极记录自发性及感觉诱发的放电活动，并通过电流和注射将生物胞素注入所记录的神经元中。

随后，对脑组织进行生物素染色处理。最后，通过连续切片对生物素标记的神经元进行数字化重构，以实现细胞类型的分类。最终，单个神经元的胞体旁记录可实现对皮层网络中感觉处理与结构信息的研究。

该方法有助于回答神经科学中的关键问题，例如在感觉信息处理过程中，不同细胞类型和皮层层次各自发挥什么作用？通常，需要使用该方法的研究人员会面临困难，因为在染料填充过程中很容易导致神经元死亡。通过制备高质量的电极尖端，可提高生物胞素（biocytin）成功填充的概率，此外，还需要经过训练的操作者精确控制微弱的电流注射。

因此，需要经验才能提高回收填充良好神经元的成功率。开始时，将一只麻醉的Wistar大鼠放置在配备加热垫的立体定位仪上。通过检测脚趾夹捏反射来确认麻醉深度。

然后插入直肠探针以维持动物的正常体温。固定动物头部，并去除手术区域的毛发。在眼睛上涂抹眼膏以防止干燥。

在手术部位注射利多卡因后等待三到五分钟，然后去除覆盖颅骨表面的皮肤。接着清除残留的组织，并用0.9%氯化钠溶液彻底清洗颅骨。确定左侧大脑半球初级躯体感觉皮层的坐标位置，并用外科皮肤标记笔在颅骨上标记该位置。

使用牙科钻从目标区域刮取骨组织。持续刮取骨组织，直至其变得透明且血管清晰可见。接着，用手术刀在薄层颅骨上切出一个小窗口。

注意操作时不要损伤硬脑膜和血管。使用外科皮肤标记笔标记颅骨开窗的边缘。为提高可视性，先在干燥的颅骨上涂抹一层薄薄的超级胶水，然后使用牙科水泥构建一个灌注槽。

在关闭颅骨开孔时，将对侧的胡须修剪至恰好五毫米，以利于观察其可见性。在开始记录前，用黑色睫毛膏标记修剪过的胡须，并使用硼硅酸盐玻璃制备膜片电极。理想的电极形态应具有逐渐变细的锥形、较低的锥角，以及约一微米的尖端内径。

用添加了2%生物素的正常人工脑脊液填充膜片电极，并将该电极安装到固定于显微操作头架上的电极夹持器中，再连接至显微操作仪。为特异性靶向大鼠S1区的D二柱，将电极夹持器相对于矢状面的角度设置为34度。接着，将膜片电极移至颅骨开窗处附近。

用0.9%氯化钠溶液填充浴槽。将放大器置于桥式模式，施加正向电流注入的方波脉冲，以测定电极电阻。理想的电极电阻介于3至5兆欧之间。

建立100至150毫巴的正压，同时以方波脉冲形式施加正向电流，并以每步1微米的间距推进膜片电极。当电极与硬脑膜接触时，监测电阻的显著变化。此时，将显微操作器的坐标设为零，以便准确测量深度。

以1微米步进模式推进，直至膜片电极穿透硬脑膜，此时电极电阻会突然下降。随后解除电极的维持压力。接下来，在以1微米步进推进的同时，搜索单个神经元信号。

通过施加200毫秒的开关脉冲持续监测电极电阻，电极电阻的升高通常提示单个神经元的临近。继续推进电极，直至记录到幅值约为2毫伏的正向动作电位波形。可选择性记录自发性放电活动，并通过压电装置轻柔偏转单根须毛以确定被诱发的放电活动，从而获得用于近胞体填充的最佳条件。

推进电极，直至电阻达到25至35兆欧，且记录到的尖峰信号幅度为3至8毫伏，以开始近胞体灌注。施加正向方波电流脉冲，起始电流为1纳安。

以0.1纳安为步长，逐步缓慢增加电流，同时监测动作电位（AP）波形和频率。在方波去极化脉冲的“开启”相期间，通过观察动作电位频率的明显升高来监测膜的开放状态；在灌注过程中，锋电位波形将表现为宽度增加以及后超极化减弱。灌注期间通过调节电流大小以维持生物素灌注的稳定；当动作电位频率突然升高时，应减小或停止电流脉冲，以避免因细胞外离子（如钠离子）过度内流引起的毒性效应。

需要注意的是，每个神经元对填充过程的反应都会有所不同。因此，必须根据记录条件调整胞体旁标记参数。在停止电流注入后，应密切监测信号变化。

填充结束后，动作电位波形通常会变宽，并表现出显著减弱的后超极化，这是神经元恢复期间的典型特征；当动作电位波形恢复至原始特性时，表明细胞所受机械应力已降低。以每步一微米的距离逐步回撤膜片电极，直至动作电位幅度下降；随后等待至少一小时，使生物素充分在细胞内扩散，同时密切监测动物的体温和呼吸。最后，获取脑组织样本并进行处理，以评估紧邻胞体标记的质量。

这些图像显示了初级躯体感觉皮层中通过膜外填充标记的神经元。该副矢状位神经元的切向视图展示了树突与轴突在尺寸上的差异。在此幅膜外标记神经元的数字重建图中，神经元投射图像以高分辨率、低放大倍数呈现，并叠加了自动数字重建结果，其中轴突以蓝色显示，树突以红色显示。

此处放大了方框区域，以显示贯穿整个轴突长度的轴突终末。在本段最终动画中，我们以一只大鼠初级体感皮层的五层厚簇状旁锥体神经元为例，展示了其重建流程。该流程包括以100倍放大倍数重建树突和轴突形态，以及以4倍放大倍数重建桶状结构轮廓。

结果是获得完整的三维重建，随后将其配准到标准化参考框架中，以对形态学特征进行定量分析。因此，活体中的邻近胞体标记可实现卓越的标记质量，从而可靠地重建完整的三维形态。本文展示了在乌拉坦麻醉动物中使用该方法的操作过程。

然而，轴突-胞体记录也可用于清醒且头部固定的动物，以研究在主动探索环境过程中不同细胞类型和脑层所起的作用。观看本视频后，您应能更好地理解如何对单个神经元进行生物素标记，以实现战后识别及形态学重建。