结合内在信号成像与双光子成像技术实现新皮层特定功能微区神经元的靶向标记

本实验的总体目标是精确定位功能图谱中的微区，以高分辨率研究神经元的结构与功能。首先，在大脑皮层较大区域上进行内在信号成像，获得目标刺激特征的功能图谱；第二步是确定该图谱中需要进行高分辨率光子成像的精确位置。

接下来，将装有荧光染料的移液管精确定位后，对神经元进行荧光标记。最后，采集神经元反应或结构的高分辨率光子图像。最终，可利用内在信号特征图定位感兴趣区域，例如朝向选择性旋涡奇点，进而针对该区域在单神经元分辨率下开展研究。

本方案的主要优势在于，仅需对系统进行少量快速调整，即可使用相同的显微镜设置在不同空间尺度上对大脑皮层进行成像。这使得研究人员能够结合这些技术，利用低分辨率的固有信号成像图谱来指导选择特定的神经元区域，并用荧光探针标记该区域以进行高分辨率成像。实验动物已根据机构动物护理与使用委员会批准的方案进行麻醉，颅骨已暴露并清理干净。

已使用牙科水泥将带有中心矩形开口的不锈钢头板固定在颅骨上。头板顶部的金属腔室可作为浸水物镜成像时的储水容器。头板已通过金属柱固定在XY平台上。

使用牙科钻头在头板的矩形开口内大面积磨薄颅骨。必要时使用骨蜡止血。磨薄的区域必须超出计划开颅范围的边界。

然后在颅骨上钻出一个 2 × 2 毫米的方形轮廓，用于开颅。定期用新鲜的人工脑脊液冲洗腔室，以清除骨碎片并尽量减少对下方皮层的热量传导。现在，用一把3号镊子将骨片抬起。

使用5号镊子和Vannas弹簧剪除去硬脑膜的上层，保留最底层完整。最深层硬脑膜呈透明状，其下的血管应清晰可见。滴加一滴温热的、含2%琼脂糖溶解于人工脑脊液（aCSF）的溶液，立即在颅骨开窗处覆盖盖玻片。

首先，在盖玻片外周包裹一层浸有脑脊液的凝胶泡沫，以防止在进行内在信号成像时琼脂干燥。然后将内在信号成像用的CCD相机连接至双光子显微镜顶部的标准C型接口，并在靠近XY载物台位置的气浮台上放置照明光源，将导光管固定于颅窗上方。撤回主分光镜及海山口下方的反射镜，使内在信号所需的红光能够直接从颅窗传导至CCD相机。

在光路中插入红外滤光片，以防止皮层受热。然后放置一个透射绿光的滤光片，并记录皮层表面血管的数字参考图像。接着，将Z轴焦平面移动至皮层表面下方500微米处。

将绿色滤光片更换为红色滤光片，以照射皮层并测量内在信号。确保皮层受到均匀照明。屏蔽视觉刺激显示器产生的光线对颅窗的干扰，呈现一系列视觉刺激，并记录反射光数据图像以生成方位取向图。在10分钟内，采集对应于八种刺激序列（每种方位包含两个运动方向，共四种方位）重复四次的数据。

现在分析内在信号数据，生成如图所示的伪彩色方位图。然后选择用于双光子标记神经元的潜在目标区域。例如，方位图中所有偏好方位汇聚的中心点，即方位螺旋奇点。

接下来，将方位图与皮层表面血管结构图像叠加，利用功能区的分布以及大脑表面大血管的位置来选定目标区域，避开含有大血管和动脉的部位。按照书面实验方案中的说明，配制荧光染料D溶液，并拉制一支长锥形移液管。向移液管中装入五微升（5 µL）染料混合液。

然后去除最深层的硬脑膜，以方便移液管插入，并获得如本示意图所示的高质量双光子图像。移液管必须以30度角插入皮层，以便在成像腔室与物镜之间穿行。因此，移液管进入皮层表面的位置不会直接位于目标兴趣区域的正上方。

例如，若要标记皮层表面以下 200 微米的目标区域，则移液管在皮层表面的穿入位置应位于目标位置侧方约 350 微米处。移动 XY 载物台，使皮层表面的穿入位置位于 20 倍或 40 倍物镜的中心。一旦穿入位置位于物镜正下方，将物镜的 Z 轴位置升高 2 毫米。

然后打开绿色的落射荧光光源，观察移液管中的红色Alexa染料，并移动移液管，使管尖位于皮层表面穿刺位置的上方。在显微镜目镜下使用明场照明观察移液管尖端，缓慢降低移液管，直至管尖到达皮层表面的预定穿刺位置。接着取下物镜，使用无绒吸液尖头将颅骨开窗处多余的脑脊液吸走，并擦干邻近的骨组织。

然后在脑表面滴加一滴温热的3%琼脂糖（溶解于人工脑脊液中），以稳定大脑皮层。待琼脂糖凝固后，插入40倍物镜，并用人工脑脊液重新充满记录 chamber。接着，利用显微操作仪的对角轴移动移液管，直至其尖端到达大脑皮层的预定深度。

偶尔以压力喷射方式向DI混合液中喷出少量气流，可降低移液管尖端在到达第二层时发生堵塞的可能性；向DI混合液中喷出三小股气流，将照亮细胞外空间，并显示出密集排列的圆形细胞体所形成的暗影，从而在直径为300至600微米的皮层球形区域内定位神经元胞体进行加载。使用30至90次脉冲将Dix混合液注入细胞外空间，每次脉冲持续1秒，压力为2至10 PSI。

注射完成后，等待几分钟，然后移除移液管和物镜。荧光钙指示剂将在一小时内被神经元完全吸收。最后，移除用于下载的 aros，并冲洗记录室。

在颅窗表面滴加一小滴2%至3%的琼脂糖，并迅速盖上盖玻片。将高数值孔径（NA）20倍物镜插入物镜架中，并重新对准物镜下标记的皮层区域。使用XY载物台遮挡颅窗，避免外界光源干扰，采集标记神经元的高分辨率活体图像。

此外，单细胞电穿孔可用于研究树突形态或进行树突的功能成像。在该方法中，根据书面方案制备DI。然后在实验步骤的适当阶段，将移液管尖端置于神经元胞体膜附近，并使用axo施加一至三次脉冲。

通过双光子显微镜可以清晰地观察到神经元被染料立即填充的过程。该图像显示了使用双光子成像技术观察到的视觉皮层第二至第三层中细胞体被荧光钙指示剂OGB-1:00 AM标记的区域，比例尺代表100微米。此图像展示了来自上一幅图像相同位置的单个神经元细胞体的方向偏好性。

在成像区域中心的旋涡奇点周围，可以看到偏好刺激方向的有序图谱。此处显示的是通过内在信号成像获得的方向图。黑色方框对应于之前双光子图像中所示的区域。

该图像显示了一个神经元的树突和细胞体，并叠加了方位图。该神经元在双光子引导下通过电穿孔导入了Alexa Fluor 594。通过在体采集Z轴层扫图像，并使用NeuroLucida软件离线追踪树突过程。

在单细胞电穿孔之前，通过内在信号成像获得了方位图。比例尺代表100微米。该来自皮层第一层的10微米Z轴投影显示了顶树突。

红色箭头显示了树突上的棘突，而这些来自皮层第二至第三层的10微米Z轴投影则显示了基底树突，其中红色箭头指示棘突，白色箭头指示轴突。该方法可用于在不同空间尺度上研究皮层的功能图谱，并能够精确定位特定感兴趣区域内的神经元。在功能图谱中，我们已展示了该方法在研究方位选择性图谱中的应用，但该方法也可扩展至其他视觉特征图谱，如视网膜图谱、拓扑图谱、眼优势图谱和运动方向图谱，或扩展至其他具有功能组织图谱的感觉模态，例如编码躯体感觉或听觉的图谱。