通过3DISCO技术在细胞水平上对完整生物系统进行成像

以下实验的总体目标是对荧光标记的完整生物样本进行成像，而无需进行组织学切片。该目标通过将固定后的组织依次浸入有机溶剂中，直至实现完全透明来达成。第二步是。

利用激光扫描显微镜对透明化组织进行三维成像。随后，分析成像结果，即可根据采集的三张去片层图像，重建完整脊髓和脑组织中的神经元结构。该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，即如何绘制全脑和全脊髓的神经元及GAL连接图谱。

该技术的应用前景可拓展至神经退行性疾病的治疗，因为现在我们能够可视化整个神经系统中的神经完整性。尽管该方法可揭示神经系统的组织结构，但也可应用于其他器官，例如肺或肿瘤组织。一旦掌握，该技术对于脊髓或肺等较小器官仅需数小时，而对于大脑则大约需要一到两天。首先，为每份采集的组织准备一个玻璃小瓶，每瓶中加入两到三毫升新配制的50% THF。

然后将固定的器官转移至透明化溶液中，并 tightly 封闭管子。将管子置于旋转仪上，并用铝箔包裹，以恒定的 30 RPM 速度搅拌样品适当的时间。随后移除透明化溶液，并使用新的聚乙烯管或移液器将组织悬浮于下一溶液中。

如表格中在最终透明步骤所述，将样品保留在溶液中，直至其完全透明，以便进行双光子或共聚焦显微镜观察。一旦完成完全透明，立即将样品置于成像载玻片上，并使用牙科水泥在组织周围制作一圈边框。

在牙科水泥完全变硬之前，立即用最终的透明溶液填充样品池，然后迅速将透明处理后的样品置于池中央，并用盖玻片覆盖。轻轻按压盖玻片，直至其被牙科水泥完全密封，并与透明后的组织表面紧密接触，以便进行光片显微成像；一旦完成透明处理，立即安装样品，并手动旋转样品架上的螺丝以固定样品。随后，将样品浸入已注入适用于成像组织的最终透明溶液的光片显微镜成像腔中。

然后以显微镜所能提供的最佳分辨率采集覆盖整个透明化组织的Z轴扫描图像，并对感兴趣区域进行放大以采集更高分辨率的图像。图像采集完成后，使用Amira软件中的resolve RT模块载入图像序列。图像序列载入后，在图像读取参数窗口中输入正确的体素尺寸，然后点击确定。

接下来，选择多平面视图子应用程序。然后使用主滑块和厚度滑块选择最佳的投影厚度和灰度值阈值。最后，使用裁剪角落模块在不同的三维方向上浏览切片。

为了可视化样本，绘制神经元的结构组织对于理解其在健康和疾病状态下的功能至关重要。尽管三种透明化方法可应用于多种器官，但它们在追踪脊髓和大脑中的长距离神经元连接时尤为有用。例如，利用对大段透明化脊髓进行的超显微成像扫描，可以在啮齿类动物脊髓中追踪轴突连接长达数厘米，如图中所示。

以类似方式，可对整个透明化的小鼠脑和海马体进行成像，以追踪大脑中的神经元连接。当使用共聚焦显微镜或多光子显微镜时，成像分辨率可显著提高，尤其是在Z轴方向上。例如，对来自GFPM品系小鼠的透明化脊髓进行多光子成像，可在整个1.5至2毫米深度的脊髓范围内实现无缝图像。

对透明化脊髓进行共聚焦显微镜成像，同样可获得更高的分辨率。利用双光子显微镜对透明化脑组织进行成像，能够提供极高分辨率的图像，用于观察神经元结构的精细细节，包括树突棘。三种DISCO透明化样品可通过多种方式进行标记。

例如，可以使用与荧光示踪剂偶联的凝集素标记脑和脊髓的整个血管系统，从而用于研究健康和疾病状态下的血脑屏障。利用三种DISCO透明化技术，还可以对大组织中的微小细胞进行成像。例如，小胶质细胞和星形胶质细胞均被广泛认为与神经退行性病变的病理过程密切相关，包括阿尔茨海默病和创伤性损伤。

利用三个disco，可以研究它们在脊髓中的密度和分布情况。非神经组织也可进行成像。例如，整个啮齿类动物肺部的克拉拉细胞可通过抗体免疫标记，并在单细胞水平上无需切片即可成像。

同样，也可以对未经处理的胰腺组织中的细胞进行透明化和成像。例如，在这些胰腺图像中，经过透明化处理后可观察到荧光标记的α细胞。该方法的可视化演示非常重要，因为尽管透明化和成像步骤较为直接，但数据分析可能较为复杂。

在实施该操作过程中，一旦组织完全透明，应尽快对清晰的组织进行成像，因为荧光信号在透明溶液中会随着时间推移而逐渐降解。该技术的发展为研究人员探索精细结构和完整器官（例如绘制大脑中的神经元网络）铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何对完整器官中的细胞及亚细胞结构进行透明化处理和成像，并进一步对其进行可视化与分析。