用于大鼠心力衰竭的细胞治疗：心肌梗死双侧开胸术及细胞与生物基质的心外膜植入

本实验的目的是对大鼠实施双侧开胸术，以进行冠状动脉结扎和心外膜给药。首先在第四肋间进行开胸术，随后结扎左前降支冠状动脉（LAD）。

两周后，在第五肋间再次进行开胸手术。最后，将细胞与基质施加于梗死区域跳动的心脏表面。最终，通过超声心动图评估心脏功能，并通过测量梗死面积进行组织学分析。

与现有方法（如胸骨切开术）相比，该技术的主要优势在于其微创性。本视频将演示该操作步骤，并由我们实验室的 ine Lopez 及其合作者完成。所有动物实验均遵循 F-E-L-A-S-A 的建议以及瑞士动物保护法。按照文本方案，将大鼠放血处死后，分离并清洗股骨，然后使用剪刀剪去骨的两端。

然后用无菌 PBS 冲洗骨髓，将骨髓注入 15 毫升离心管中。将收集的骨髓以 300 × g 离心 7 分钟。弃去上清，加入 3 毫升红细胞裂解缓冲液。重悬沉淀，室温孵育 1 分钟，重新悬浮后再次以 300 × g 离心 7 分钟。

将沉淀物重悬于无菌培养基中。在150毫升培养瓶中加入额外的细胞培养基，并在孵育的第二天接种细胞。更换培养基以去除未贴壁细胞，并每隔两天更换一次培养基，持续两到三周，直至达到所需的细胞密度。

进行首次胸廓切开术时，首先称量大鼠体重，并据此设置呼吸机参数。呼吸机的呼气流量将自动确定。随后剃除胸部左侧的毛发，打开加热垫并将其温度设置为 37 摄氏度。

按照文本方案将大鼠麻醉后，在将其仰卧置于加热垫上之前，先进行足趾或尾部夹捏检查。使用14号静脉留置针进行气管插管，然后将插管导管连接至啮齿类动物呼吸机。呼吸机设定参数为：氧流量2.5升/分钟，异氟烷浓度2.5%，潮气量2毫升，呼吸频率90次/分钟。准备含有0.1毫克/千克剂量布托啡诺的皮下注射器后，先皮下注射三分之一剂量的溶液，随后使用1%聚维酮碘溶液对操作区域进行消毒。

接着，在第四肋间隙处垂直于胸骨切开皮肤，并分离三层胸壁肌肉。然后打开第四与第五肋骨之间的第四肋间隙。使用小型牵开器撑开肋骨，暴露心脏。

随后小心打开心包膜，找到左前降支冠状动脉（LAD），在距心房下方四毫米处使用7.0缝线进行结扎。然后在靠近胸骨处及远端位置使用3-0缝线，根据缺血区域的颜色变化进行控制。缝合两针，用于关闭肋间间隙。

收紧远端缝线。夹闭呼吸机排气管路两秒钟，以使胸腔膨胀并避免发生气胸。随后收紧第二道缝线。

将肌肉层复位。然后使用5-0缝线，以1%聚维酮碘溶液闭合皮肤切口。对缝合部位进行消毒，并注射剩余的布托啡诺溶液。

关闭麻醉系统并拔出插管导管。将大鼠置于装有保温灯的笼子中，保持1至2小时，然后送回IVC系统。首次开胸术后两周，伤口已完全愈合，瘢痕几乎不可见。

按照本视频前面所述的手术准备流程处理大鼠后，在第五肋间沿垂直于胸骨的方向切开皮肤。分离三层肌肉，打开第五和第六肋骨之间的第五肋间。使用小型牵开器撑开肋骨，暴露心脏。

若有粘连，使用精细镊子小心分离。接着，寻找结扎下方呈现苍白区域的梗死区。必要时，在心尖处插入一段10厘米长的7-0缝线，轻轻牵拉以更好地观察左心室。

然后将细胞和基质应用于心脏缺血区域的表面。按照文本方案所述，细胞经离心沉淀后，取四次10的6次方个细胞，将其沉积到心脏表面，再使用纤维蛋白封闭剂覆盖。胶层可将细胞固定在心脏表面。

从心尖位置移除缝线后，将肌肉层缝合复位并对动物进行消毒。如本视频前面部分所示。如本 Kaplan 生存曲线图所示，术后动物体重下降，但随后迅速恢复，并在不受所施加治疗影响的情况下重新增重。首次胸廓切开术后，动物存活率较高；而使用纤维蛋白和/或细胞治疗的动物组，其存活率低于其他组，如本图所示。

然而，二次手术后的总体生存率仍然保持较高水平。通过超声心动图评估开胸术后心脏功能。这些代表性的M型图像显示了健康动物与心肌梗死动物的情况，表明在左前降支冠状动脉（LAD）结扎两周后，左心室壁收缩功能已完全丧失。在总共104只动物中，记录了LAD结扎两周后的左心室缩短分数。

频率分布显示该方法具有合理的可重复性，变异系数为17%。该图通过LAD结扎术后2周和6周测得的射血分数，以图形方式展示心脏功能。在此期间，心脏功能持续下降。心脏重构也在此期间发生，表现为左心室（LV）容积在收缩期和舒张期均增加。最后，心脏切片的金染显示，纤维化组织最终形成透壁性瘢痕，至LAD结扎术后6周已发育完全。一旦掌握，若操作得当，该技术可在30至40分钟内完成。

观看本视频后，您应能较好地掌握如何实施微创双侧开胸手术。