组织工程：构建用于递送分层细胞片的多细胞三维支架

本实验的总体目标是利用细胞片构建组织工程补片。首先，用温度敏感性聚合物聚丙烯酰胺（也称为 p nipam）处理细胞培养表面；第二步是在该聚合物包被的表面上高密度培养目标细胞，以形成细胞片。

接下来，通过降低培养板的温度使细胞片从培养板上抬起，从而使细胞以完整的细胞片形式脱离培养板。最后一步是将完整的细胞片在不撕裂的情况下转移至用于植入的支架结构上。最终，可通过简单的光学显微镜观察，证实细胞片在操作过程中已被成功制备并保持完整，从而构建出可植入的组织工程材料。

与现有将细胞嵌入类似水凝胶的基质中的方法相比，该技术的主要优势在于，能够生成并维持细胞的侧向边界，形成功能性组织。这些方法还可推动组织工程领域的进一步研究，例如，当细胞处于这种有序状态时，移植后其存活情况如何？

本次实验操作将由我实验室的博士后研究员William Turner博士和Ms. Snapshot sand do演示。开始此操作时，将2.6克P nipam溶解于2毫升60%甲苯和40%己烷的混合溶液中。接着，将混合物加热至60摄氏度并持续10分钟，同时搅拌，直至P nipam完全溶解。

然后将滤纸剪成直径60毫米的圆形，放入布氏漏斗中。通过布氏漏斗将溶液过滤至一个预先称重的玻璃烧杯中。将烧杯及其内容物置于真空干燥器中过夜。

随后，称量含有 P nipam 的烧杯。接着向 P nipam 中加入异丙醇，制备成 50:50（重量:重量）的溶液。然后取两毫升该溶液置于组织培养板表面，并在紫外光下照射五分钟以进行包被。

然后在用于细胞培养前，用 2 毫升温热的 PBS 洗涤培养板两次。在此步骤中，首先通过用 2 毫升温热的 PBS 洗涤细胞，分离大鼠主动脉平滑肌细胞。接着，向细胞中加入 3 毫升胰蛋白酶或其他消化解离溶液，孵育 5 分钟。

然后向细胞中加入3毫升含有10% FBS的培养基或PBS。之后，将细胞收集到锥形管中并进行计数。随后，以1000 RPM离心5分钟。

吸去上清液，并将细胞重悬于生长培养基中。接着，将含有细胞的培养基以能够达到100%汇合度的浓度接种到35毫米的温敏培养皿中，于37°C孵育过夜，以维持细胞对培养皿的黏附。随后收集内皮细胞，并将其分散成单细胞悬液。

使用一倍体积的胰蛋白酶、乙酸或细胞解离缓冲液也可用于单细胞分散。接着，加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂或含10%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS）以中和胰蛋白酶活性。然后将细胞收集至15毫升锥形离心管中。

使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算适用于补片尺寸所需的体积。对于直径四毫米的补片，使用200万个内皮细胞；之后，吸取200万个细胞并将其置于新的15毫升锥形管中。然后以5分钟离心，吸除上清液，使细胞在锥形管中形成沉淀。接下来，按照公司提供的操作规程制备高 aurin 水凝胶。

按1:1的比例混合高 aurin 与液态明胶。随后将最终总体积的80%转移至含有细胞沉淀的锥形管中，用高 aurin 明胶混合液重悬内皮细胞。接着，将重悬的细胞转移至纤维基质中。

加入交联剂，体积为终总体积的20%，在37摄氏度孵育一小时。在此步骤中，从培养箱中取出含有细胞的35毫米P nypa处理板，放入细胞培养操作台。在室温下，迅速吸去细胞中的培养基。

然后，在凝胶仍保持温热时，向培养皿中加入 2 毫升 37 摄氏度、6% 的正常明胶，将金属网格放入明胶中，使其完全浸没于正常明胶表面以下。随后，将整个培养皿置于冰上 5 至 7 分钟，使明胶凝固。7 分钟后，用刮铲小心地将明胶边缘与培养皿壁分离。

接着用镊子将金属网格从培养板上提起。将细胞片转移到培养皿中，并放置在纤维基质水凝胶组合物的上方。向组织培养板中加入 2 毫升 37 摄氏度的培养基，过夜培养，使细胞片充分黏附于水凝胶表面。

在此期间，待溶液升温后，移除金属网架。此处，细胞在经Pippa包被的表面培养，随后以细胞片层的形式整体转移至纤维基质表面。早期未使用明胶金属网架进行转移的实验，导致形成了细小且破碎的细胞片。

该图像为早期贴片设计的复合图，结合了线粒体示踪剂、红色染色的大鼠主动脉平滑肌细胞、钙绿荧光标记的人脐静脉内皮细胞以及透射光图像。此图为细胞片层与更坚固的基底纤维基质水凝胶结合后的复合图像。该复合图像通过更坚固的基底纤维基质从贴片底部拍摄获得，而该细胞片层的复合图像则是在基底纤维基质上方拍摄的。

水凝胶复合细胞在片状覆盖层中覆盖于基底纤维基质水凝胶复合物之上，边缘处因细胞聚集而显示出增强的荧光。此为该构建体的透射图像，其中可见自然纤维基底基质在DPI下的自发荧光。通过该方法，其他组织工程实验可进一步探讨细胞排列与细胞间通讯如何影响移植成功率等问题。

该技术可使组织工程领域的研究人员探索多种细胞联合移植的复杂方法。进行此操作时，切勿忘记使用溶剂可能具有极高危险性，应始终采取预防措施，例如佩戴合适的口罩和使用化学通风橱。