通过定量RT-PCR对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

本实验的总体目标是利用单细胞定量反转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）对单个人类胚胎干细胞的基因表达水平进行分析。该目标首先通过荧光激活细胞分选技术，将单个细胞分选至含有细胞裂解缓冲液的96孔板的各个孔中来实现。第二步是将RNA反转录，以从单细胞裂解物中生成cDNA。

接下来，通过聚合酶链式反应对cDNA进行扩增。最后一步是对扩增后的cDNA进行定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）。该检测方法最终可用于研究异质性细胞群体（如人类胚胎干细胞）中的基因表达。

与现有的单细胞定量人工血管技术相比，该方法的主要优势在于其结合了脑电图（EEG）技术，并且在 Fax 纯化之前具有更高的稳健性。将 OCT4-EGFP 人胚胎干细胞或 Hess 从 60 毫米培养皿上分离，吸除全部培养基后，加入 1 毫升 Accutase，于 37°C 孵育 20 分钟。

弃去上清后，加入1毫升人ES培养基，通过离心收集细胞，用FACS缓冲液重悬细胞，并将细胞浓度调整至每毫升1×10⁶个细胞。接着，将细胞样品通过装有35微米滤网帽的细胞筛滤管。细胞分选前将试管置于冰上保存。

开始此操作前，先配制主混合液，其中包含一微升单细胞DNA酶一和九微升单细胞裂解液。每孔取十微升上述混合液，加入96孔PCR板的各孔中，用于后续的PCR分析程序。将细胞分选仪用于将单个EGFP阳性细胞分选至96孔PCR板的各个孔中。细胞分选完成后，在室温下孵育样品五分钟，以实现细胞裂解。为终止裂解反应，加入一微升终止液，并在室温下继续孵育两分钟。

开始此实验步骤时，首先向96孔板的每个孔中加入0.5微升浓度为20微摩尔的SMAT 15和SMAA引物Eloqua溶液。将样品在80摄氏度下加热5分钟。然后加入4微升5倍缓冲液、2微升DTT、1微升逆转录酶以及1微升dNTPs。

在每个孔中使用PCR仪进行逆转录反应。将PCR程序设置为42摄氏度反应90分钟，随后85摄氏度反应5分钟。逆转录完成后，为灭活逆转录酶，向每个cDNA样品中加入4 µL exo试剂，在37摄氏度孵育15分钟以消化过量的寡核苷酸引物，随后在80摄氏度反应15分钟。

为了使外切酶试剂失活，使用2纳米浓度的SMAP2引物制备PCR反应混合液。向每个逆转录样品中加入10微升PCR反应混合液。

进行扩增，包括20个循环的变性、退火和延伸；在完成样品扩增后，在两个独立的96孔板中分别进行两组定量反转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），以验证R-T-P-C-R结果。向每个96孔板的每孔中加入10微升（µL）2×SYBR Green PCR预混液、1微升（µL）扩增后的cDNA、两种引物以及7微升（µL）水。设置程序：95 °C持续3秒，随后60 °C持续30秒。

经过40个循环，去除一个跪步以减少引物误差。在本研究中，将Hess的总RNA微克量稀释至纳克和皮克水平，以评估低量总RNA条件下技术变异性和检测差异。使用池化苞片的mRNA对G-A-P-D-H基因进行定量反转录聚合酶链反应（R-T-P-C-R），mRNA浓度从每微升10纳克连续稀释至每微升0.1皮克。每个点表示连续稀释的mRNA以及通过流式细胞分选获得的单细胞mRNA的CT值。

每个样本与QR RT-PCR结果之间均观察到相关性，其中若干单细胞显示出相似的CT值。使用流式细胞分选技术（FACS）从OCT4 EGFP报告基因hESC细胞系中分选并筛选出EGFP强阳性细胞。结果显示，EGFP阳性细胞群比例约为60%，与阴性细胞群相对照，表明不同批次的逆转录与扩增反应之间具有良好的一致性。

将纯化的单细胞裂解液均分为两份，并对每份分别进行处理以进行批次间比较。结果显示，单细胞裂解液每半份之间的OCT4的CT值存在显著相关性。单个细胞基因表达的热图显示OCT4表达水平一致且强健，而另一干细胞标志基因NANOG的表达水平则有所不同。综合来看，我们的结果表明，该单细胞基因表达检测方法可用于研究多能干细胞群体的异质性。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何正确进行单细胞转录组的 QITP 操作。