小鼠胚胎细胞多重单细胞mRNA测序分析

单细胞mRNA测序被广泛用于在单细胞水平上理解生物学过程。多重测序策略的出现进一步拓展了其应用，使得在单次实验中可对多个样本进行分析，显著降低了成本并避免了批次效应。本实验操作将由本实验室的博士后魏 Feng和技师Andrew Przysinda进行演示。

计数后，将从胚胎第18.5天的心室中分离的细胞分成每份5 × 10⁵个细胞的等分试样，每份用新鲜PBS洗涤两次。每份样品将细胞沉淀重悬于180 µL PBS中，并向每管中加入20 µL锚定条形码储备液，轻轻混匀。冰上孵育5分钟后，再向每管中加入20 µL共锚定条形码储备液，轻轻混匀，继续冰上孵育5分钟。随后用1 mL含1%牛血清白蛋白的冷PBS洗涤细胞三次，每次洗涤后通过每管一个40 µm细胞滤筛将样品滤入新管中。

计数后，将芯片 B 安装到芯片架中，然后向第一行未使用的孔中加入 75 微升 50% 甘油溶液，向第二行未使用的孔中加入 40 微升，向第三行未使用的孔中加入 280 微升。请注意，此处使用训练芯片以演示操作流程。将适量的细胞悬液和无核酸酶水通过轻柔吹打加入主混合液中。

将75微升所得细胞溶液缓慢加入第一行样品孔底部中央，避免产生气泡。在加入凝胶珠前，先将凝胶珠涡旋振荡30秒，然后缓慢将40微升凝胶珠加入第二行凝胶珠孔底部中央，避免产生气泡。沿第三行分隔油孔的孔壁加入280微升分隔油。

将垫圈安装到芯片上时，不要按压垫圈，并保持垫圈水平，以避免润湿垫圈。将带有垫圈的组装芯片载入 Chromium 控制器中，运行 Chromium Single Cell B 程序。注意：屏幕会显示“Chromium Training”（用于训练芯片），但在实际实验中，屏幕将显示“Chromium Single Cell B”。程序运行完成后，立即取出芯片并丢弃垫圈。

将盖子向后折叠，以45度角露出孔板，检查液体水平，确保无堵塞。从回收孔的最低点缓慢吸取100 µL乳状凝胶微珠，并检查微珠的均匀性。将乳化后的微珠沿置于冰上的新PCR管管壁加入，然后将管子放入热循环仪中进行逆转录。

为准备扩增cDNA，在室温下向样品中加入125微升回收试剂。不应观察到不透明液体，避免移液或涡旋。等待60秒后，从管底缓慢移除回收试剂，并向样品中加入200微升涡旋珠纯化混合液。

用移液器将混合物吹打10次，然后在室温下孵育10分钟。接着，将样品置于磁力架的高位。待溶液澄清后，吸除上清液，并向沉淀中加入200微升80%乙醇。

30 秒后，去除乙醇，并重复洗涤两次。最后一次洗涤后，短暂离心样品，将离心管置于磁力架的低位位置，使样品晾干，时间少于两分钟。样品干燥后，将离心管从磁力架上取下，加入 35.5 µL 新鲜配制的洗脱液。

室温孵育两分钟后，将样品置于磁力架的高位，直至溶液澄清，随后将35微升样品转移至新的管条中。使用基于脂质的条形码策略进行cDNA扩增时，向35微升cDNA样品中加入扩增反应混合液，充分混匀后短暂离心。离心结束后，将样品放入热循环仪中，按照相应的cDNA扩增程序进行孵育。

向100微升样品中加入120微升选择性试剂和100微升超纯水，用移液器将所得的0.6倍浓度选择性试剂吹打混合15次。室温孵育5分钟后，将样品置于磁力架上直至溶液变澄清。将上清液转移至1.5毫升低吸附离心管中，用于构建多重编码的条形码cDNA文库。

请务必同时保存上清液和底物，因为上清液中含有带条形码的 cDNA，而底物中含有内源性 cDNA。用 80% 乙醇纯化内源性 cDNA，并用 40 µL 洗脱缓冲液洗脱 DNA，然后在构建内源性转录本文库之前进行内源性 cDNA 的质量控制检测。在文库构建之前，应对 cDNA 的浓度进行定量和质量评估。

构建的文库（包括内源性 cDNA 文库和条形码文库）在测序前也应进行定量和质量评估。测序后，可分析每个单细胞中的条形码表达情况。例如，在本分析中，观察到八组单细胞，每组唯一表达一种条形码，代表来自八个不同样本的细胞。

此外，部分细胞未表达任何条形码，因此被定义为阴性细胞，而另一些细胞则表达了两种不同的条形码，代表双细胞（doublets）。利用单细胞（singlet cells），可通过细胞类型注释、新及稀有细胞类型的鉴定、解剖区域比较分析以及基因本体通路分析（如细胞周期各阶段的分离）来评估细胞异质性和分子调控机制。如果条件允许，建议对乳液中的凝胶微珠进行成像，因为图像能够直观地显示至此步骤的实验是否成功。

样本多重化技术为设计实验提供了极大的灵活性。在观看完本演示后，希望您将更有信心开展自己的实验研究。