监测由快速生长的肿瘤形成细胞分泌因子招募的血管系统的功能与形态

以下实验的总体目标是利用超声和内窥显微镜技术，展示癌细胞分泌的一组因子所具有的促血管生成潜力。该目标首先通过植入一个基质栓塞，在小鼠体内构建一种类似肿瘤的微环境（不包含肿瘤细胞）。随后，评估该栓塞内的血管密度以及功能性血管所占的百分比。

在最后一步中，可对血管的形态进行可视化观察。最终，通过两种互补的活体成像模式，可在不同时间点对细胞分泌的促血管生成因子与抗血管生成因子之间的平衡及其对血管生成的影响进行体外、体内及动态评估。该技术相较于传统的Matrigel栓塞实验等现有方法的主要优势在于，能够在利用互补性活体成像模式的同时，分析细胞所分泌的一系列因子。

演示该实验步骤的是我实验室的博士研究生 She Ran F Andra。为了利用超声评估细胞外基质（ECM）模拟凝胶塞的血管化情况，首先将含有 80 微升新鲜配制的条件培养基的 1.5 毫升离心管置于冰上。该操作中最关键的步骤是使用预冷的枪头将凝胶注入且不产生气泡。轻柔混匀并缓慢注射可确保凝胶的最佳给药效果。

然后使用预冷的1000微升枪头，将600微升预冷至4摄氏度、过夜保存的解冻ECM模拟凝胶缓慢加入培养基中，注意避免产生气泡。通过脚趾夹捏法确认小鼠麻醉后，剃除每只小鼠腹部的毛发，并使用预冷的1毫升注射器（配备27号针头）缓慢皮下注射。

每只动物注射一支 EEND DPH 管中的内容物。待全部体积注射完毕后，将针头保持在原位数分钟，直至凝固发生。三周后，再次剃除小鼠腹部区域的毛发，并用脱毛膏去除多余毛发，然后将小鼠仰卧固定在显微操作仪的载物台上。

接下来，用生理盐水填充一支带有30号针头的1毫升注射器。然后将针头插入尾静脉中。固定针头并松开注射器。

现在将换能器置于所需扫描区域的中央，点击“3D”以初始化三维电机平台。再次输入扫描距离和步长，然后按“扫描”。

确认三维图像数据中已完整扫描到整个栓塞物。如果未完整显示，请调整换能器位置，使整个栓塞物可见，并重新扫描该区域，方法如前所述。接下来选择对比模式，调节时间增益补偿（TGC）控制以使图像变暗，使用试管混匀器激活微泡45秒。

然后将50微升微泡与50微升生理盐水在1毫升注射器中混合。将含有松动生理盐水的注射器更换为含有活化微泡的注射器，并将稀释后的微泡注入每只小鼠的尾静脉。等待数秒钟，使微泡达到稳定状态，然后点击3D并选择扫描以获取三维图像。

增强对比度的图像。点击“保存”以存储图像数据，然后选择“3D”并破坏3D。为破坏微泡，再次点击“3D”并选择扫描，以获取破坏后的图像循环。

然后再次点击已查看的商店。接下来在参考设置中，点击创建参考，然后选择研究管理，以打开预破坏 Cena 循环。

现在点击处理cena以生成绿色对比度叠加图像。然后在超声成像软件中选择载入3D。接下来，点击模式设置，点击体积并选择平行。

然后分割一系列轮廓，以创建目标组织的三维体积，并单击完成以结束分割。为了利用光纤共聚焦内窥显微技术评估ECM模拟凝胶栓子的血管形态，需向每只实验动物的尾静脉注射200微升浓度为10毫克/毫升的FITC标记葡聚糖。随后，在距离栓子约一厘米处做一个小切口，将内窥显微探头轻轻放置在栓子表面，同时保持栓子完整。

探针就位后，使用脚踏板启动激光。当屏幕上出现荧光时，用脚踏板按下选择键以获取短至32帧长的视频。每段视频之间，将探针尖端在装有水的试管中清洗。拍摄结束后，用棉签清洁探针尖端，以分析平均血管直径。

接下来，单击“检测微血管”以打开血管检测模块窗口，然后单击“首选项”。确保“感兴趣统计量”窗口中的平均血管直径以及“显示模式”中的直方图条均已被选中。

单击“检测”以显示选定的测量结果。为了分析血管邻近区域的荧光信号强度，请选择“创建圆形 ROI”，并在感兴趣区域创建一个圆形。最后，选择“计算 ROI 内的直方图”以计算与该圆形区域相关的数值。

通过微泡造影增强超声成像可观察到，在载有U 87 mg条件培养基的凝胶塞中，功能性血管被广泛招募。相反，在含有休眠肿瘤生成细胞条件培养基的凝胶塞中，血流几乎无法检测到。在给予FITC标记的葡聚糖后，通过纤维共聚焦内窥显微镜进一步凸显了这些新生血管的形态。如这些代表性图像所示，注意载有U 87 mg条件培养基的凝胶塞中的血管呈现出典型的渗漏性、钝端、扩张的血管形态。

扩张且高度扭曲的血管还表现出不连续的缓慢血流，同时在周围区域观察到血液渗漏，血管外明显的强荧光信号也证实了这一点。一旦掌握该技术，可在数小时内完成，并可在多个时间点进行，以优化血管生成动力学。