利用预铸聚乙二醇（PEG）水凝胶在成像微孔板中简便构建血管化成骨骨髓微环境

大多数体外无血管化研究使用天然来源的基质。尽管这类基质通常对生物过程具有很强的促进作用，但其固有的生物活性使得研究单个参数的影响变得复杂。在此，我们可以选择性地添加感兴趣的因子，并评估系统如何发生变化。

在我们的空白合成水凝胶上依次接种细胞，可实现高度明确的微环境形成。在此过程中，人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）定植于水凝胶并沉积其内源性细胞外基质，从而为后续接种的内皮细胞提供基底。

这一特性在其他三维体外模型中并不常见。能够依次添加不同类型的细胞，使得构建具有高度复杂性且适用于高通量筛选的体外模型成为可能。这些模型可被进一步优化，以生成更特异的成骨性血管化微环境，并用于研究细胞和分子因子的功能。

首先，取一管人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs），通过离心形成细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于适量的基础培养基中。随后，准备含有相应体积基础培养基的50 mL锥形离心管，并加入相应的生长因子。

最后，将储备液中的hBM-MSCs以1:66,67的比例稀释，使其浓度达到每毫升1.5 × 10⁵个细胞。移除覆盖在96孔水凝胶板上的聚丙烯粘性薄膜，以进行细胞接种。将吸液管尖端紧贴孔壁，缓慢向内孔边缘移动，小心吸除覆盖在水凝胶表面的保存缓冲液。

接种时，需定期混匀细胞悬液以保持其均匀性，并向每孔中加入 200 µL 细胞悬液。随后，在37°C、5%二氧化碳及湿润的环境中培养细胞。或者，可使用自动洗板机，将吸液针头设置在距离板架至少3.8 mm处，并靠近孔的边缘，吸除保存缓冲液。

通过血清学移液管将细胞混匀，并向培养板的各孔中加入等量细胞。使用5倍物镜通过明场显微镜监测培养物的发育情况，并在接种后约30分钟采集参考图像，以评估所添加的细胞数量。首先，取融合度为80%至100%的GFP-HUVECs细胞沉淀，用适量基础培养基重悬细胞，制备成浓度为1 × 10^7 个细胞/mL的储备液。

准备50 mL锥形离心管，加入所需体积的基础培养基，并补充相应的生长因子。将储存的GFP-HUVECs按1:66,67的比例稀释，使其终浓度为每升1.5 × 10⁵个细胞。随后吸除基质细胞单层培养板中的培养基，每孔加入200 μL上述制备的GFP-HUVECs悬液。在37 °C、5%二氧化碳、湿度充足的环境中孵育，每三至四天更换一次培养基。

使用5倍物镜通过明场和荧光显微镜监测培养物的发育情况。通过仅显示GFP-HUVECs的明场和荧光图像，可以观察到不同培养物之间的差异。在无任何生长因子的情况下，培养物的发育程度较低。

然而，在存在 FGF-2 的情况下观察到更快的发育。相比之下，明场图像显示在存在 BMP-2 的情况下细胞培养密度最高。然而，血管样网络在含有两种生长因子的条件下均能形成，且在 FGF-2 存在时形成的网络最为广泛且相互连接。

建立基质细胞与内皮细胞共培养体系后，使用适合定量的荧光显微镜设置，采集GFP-HUVECs的GFP信号。对同一天获取的所有图像进行预处理，以进一步增强对比度。若使用Fiji或ImageJ，同时打开同一时间点的所有增强GFP通道图像，并打开亮度和对比度菜单。

选择一张代表中间状态的图像，并通过点击“自动”来自动调整对比度。点击“设置”，并勾选“应用到所有已打开的图像”。目视评估自动选定的范围是否适用于当前时间点的所有图像。

如有需要，手动重新调整范围，并将其重新传播到所有图像，然后将调整后的图像保存为 TIFF 文件。接着，对所有图像应用中值模糊滤波器。通过像素合并（binning）减小图像尺寸，并将其保存为灰度 RGB 彩色 TIFF 文件，存入用于定量分析的文件夹中。

此步骤可手动完成，也可使用宏以批处理模式进行。利用 ImageJ 的血管生成分析工具中的批处理模式分析所有生成的图像。然后通过检查已识别结构与原始图像的叠加效果，验证定量分析结果。

如果算法检测到原始图像中存在人工结构且可见细胞极少或无细胞，则调整预处理参数，重新分析原始图像，或排除有问题的区域。最后，通过将每个样本的数值乘以分析面积与1平方毫米的比值，将获得的数值归一化至1平方毫米的面积。对GFP-HUVECs网络的定量参数显示，在存在FGF-2时总网络长度最长，而在缺乏生长因子时最短。

指示网络中分支点的连接点数量与总长度呈现相同趋势。相反，添加了两种生长因子的条件显著减少了孤立片段的数量，表明其互联性高于未添加任何生长因子的条件。首先，取hBM-MSCs与GFP-HUVECs的共培养物，每孔加入200 µL PBS洗涤一次。

加入BCIP/NBT底物溶液，将培养物在37°C孵育，并定期观察显色情况。一旦非成骨条件下出现显色，立即用每孔200 µL的PBS洗涤。用4%多聚甲醛固定样品后，采集染色样品的彩色图像。

为了定量细胞裂解液中的碱性磷酸酶（ALP）活性，向用PBS洗涤过的培养物中每孔加入200 µL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育。每隔10分钟通过剧烈吹打上下混合以促进消化，并使用标准细胞培养显微镜监测培养物形态。随后将样品转移至2 mL离心管中，加入200 µL间充质干细胞基础培养基以抑制胰蛋白酶活性。离心后弃去上清液，将沉淀物在-80 °C冷冻保存，或直接进行下一步操作。

将细胞沉淀在500 µL裂解缓冲液中冰上解冻，并在冰上孵育30分钟。接着，在4 °C条件下以16,100 ×g离心10分钟，离心后将样品保持在冰上。避免扰动沉淀的碎片，将上清液各50 µL分别加入透明组织培养96孔板的每个孔中，每组设两个复孔。

向96孔组织培养板的各孔中加入50 µL已配制好的碱性磷酸酶试剂。轻轻振荡混匀，置于37 °C避光孵育10分钟。使用多通道移液器向各孔加入100 µL 1摩尔氢氧化钠溶液以终止反应。

使用酶标仪在410 nm处读取吸光度。进行DNA定量时，将冻存样品解冻，离心后置于冰上。避免扰动沉淀的碎片，取50 µL细胞裂解上清液，重复加入黑色96孔板的孔中。

将DNA标准品做双份加入。接着，使用多通道移液器加入50 µL DNA染色剂，然后根据制造商说明书进行孵育并读取荧光强度。利用标准曲线数值，确定并应用将测得的荧光强度值转换为DNA浓度的换算关系。

最后，通过将碱性磷酸酶的数值除以各样本相应的DNA浓度，对其进行归一化处理。对碱性磷酸酶活性的定量分析用于表征培养物的成骨潜能，结果显示，经归一化的碱性磷酸酶活性在不同条件下差异显著，随着BMP-2浓度的升高，活性呈上升趋势，并在每毫升100 ng时达到平台期。含有每毫升50 ng FGF-2的条件显示出最低的活性水平。

与 FGF-2 相比，在存在 BMP-2 的情况下观察到更广泛且更强烈的紫色染色。