利用小鼠精密切割肺片进行肺内动脉缺氧性肺血管收缩的视频形态计量分析

本实验的总体目标是分析内径为20至100微米的肺内动脉镜像中的低氧性肺血管收缩。首先，通过将低熔点石蜡灌注至肺部气道中实现肺组织固定；第二步，使用振动切片机将离体肺组织切成200微米厚的切片。

接下来，将肺组织切片放入37摄氏度的温热培养基中孵育，该培养基用常氧气体进行鼓泡，使组织切片在液体中缓慢移动。然后将单个肺组织切片转移至灌流式灌注室中，随后对横断的动脉进行血管反应性的视频形态测量分析。

最终，将评估血管管腔面积在不同处理条件下的变化。与现有的方法（如胸膜下微血管的活体显微镜观察）相比，该技术的主要优势在于能够对离体近端肺动脉的血管张力进行测量，从而实现对直径在20至100微米之间的肺内动脉血管反应性的定量分析。本次实验操作将由Anna Goldenberg及本实验室的两位技术人员进行演示。

通过颈椎脱位处死小鼠后，立即打开腹腔，移开肠袢并切断大的腹腔血管以放血。接着，使用精细剪刀刺穿膈肌。这会导致空气进入胸膜腔，从而使肺脏塌陷。

继续切割，将膈肌从下胸口分离。随后在侧方切断肋骨和锁骨。为移除肋笼的腹侧部分，需取出胸腺。

用温热的灌注缓冲液填充注射器。接着，在心脏左心室处剪开一个小孔。调节灌注缓冲液的流出速度，通过右心室缓慢灌注肺血管系统，直至肺组织呈现白色。

接下来，从气管上剥离唾液腺、小块肌肉和结缔组织。将气管与周围结缔组织分离，并在食管与气管之间插入一段缝合棉线，以备后续结扎使用。然后使用显微剪刀在相邻的两个气管软骨之间的气管上部剪开一个小孔。

用37摄氏度的温热低熔点琼脂糖填充注射器后，将其连接到一根柔性的塑料套管上，并缓慢推动活塞，直至排出套管中的空气。将套管插入气管上的小孔中，并用缝合棉线小心固定。接着，缓慢将琼脂糖注入气道，并观察肺部情况。

首先，右肺开始扩张，随后左肺开始扩张。经过30至40秒，灌注完成，双肺膨胀至与体内状态相当的体积，约为1.2至2.0毫升。根据性别、年龄和体重的不同，注射蛋清玫瑰液的速度需足够快，以防止其在操作过程中过度凝固，但又不能过快，以免损伤肺组织。

当肺部完全充满后，拔出塑料插管，并用缝合棉线结扎气管，以防止灌注液泄漏。随后在结扎线以上切断气管，并将肺和心脏整体从胸腔中取出，立即转移至冰冻的赫克斯利林格缓冲液（Hanks' Ringer buffer）中，使灌注液在数分钟内凝固。等待期间，使用速干胶将一小块香槟软木塞粘附在振动切片机的样品架上，作为肺组织的背衬支撑。待灌注液完全凝固后，分离各个肺叶。

接下来，使用万能胶将一个肺叶固定到样品台上。为了获得较小的肺内动脉的横切面，取右肺的颅侧肺叶，将肺门面用万能胶粘附于样品台，使用配备新剃须刀片的振动切片机从外周开始切片，将肺叶切成200微米厚的切片。为了获得较大的肺前动脉的横切面，将左肺的肺门与软木塞对齐，并将肺叶以此方向用胶固定于样品台，然后从外周切片以去除结缔组织。

将器官切片转移至一个装有约200毫升37摄氏度MEM的玻璃烧杯中，将烧杯放入加热柜内，并用常氧气体缓慢鼓泡，使肺切片在培养基中缓慢移动。约两小时后，填充气道的斑块将从肺组织中被清除，切片会沉降至烧杯底部。

对于肺内动脉的视频形态测量分析，将一片肺组织切片转移至流经式灌流腔室中，该腔室安装在显微镜上，并加入1.2毫升经常氧气体饱和的MEM培养基。使用连接在铂金环上的尼龙线将肺组织切片固定在腔室底部。开始以常氧气体饱和的培养基对腔室进行灌流。

使用带有10倍物镜的相差显微镜扫描肺组织切片，寻找内径在20至100微米之间的横断面动脉。找到合适的候选血管后，使用20倍物镜拍摄一段肺前动脉的图像，或如图所示，使用40倍物镜拍摄一段肺内动脉的图像，用于测量血管的内径。在实验开始前，设置软件在整个实验过程中每隔一分钟自动拍摄一次横断面动脉的图像。

触发摄影后，继续用常氧气体介质灌注腔室10分钟。然后在无流动条件下用U 466 19孵育肺组织切片10分钟，以分析动脉的收缩功能，仅选用管腔面积减少至少30%的血管。随后用常氧气体介质冲洗药物10分钟。

然后，在无灌注低流速条件下，加入 res 作用 10 分钟以扩张动脉。再次用六毫升每分钟流速的常氧气体饱和培养基灌注洗涤 10 分钟，以去除药物，随后以 0.7 毫升每分钟的流速继续灌注 10 分钟。接下来，将肺组织切片与高浓度低氧气体饱和培养基共同孵育 40 分钟。

同时通过另一组管路将缺氧气体混合物通入灌注室的气相空间。用常氧气体饱和的培养基冲洗20分钟，以去除缺氧培养基，并将灌注室气相空间中的气体由缺氧气体切换为常氧气体，以检测血管的活性。实验结束时，向灌注室中加入U 466 19，在无流动条件下孵育20分钟，以诱导血管收缩。

使用新的肺组织切片重复这些步骤，以测量另一条血管的血管反应性。首先将动脉横截面图像载入图像分析软件，开始分析。然后使用光标勾画出血管管腔区域的轮廓。

手部干燥是必要的，因为它可以避免因血细胞附着在血管壁等造成的伪影。以类似方式继续分析横截面图像。当流经孵育室的条件从一种变为另一种时，应分析每一张图像；但在条件不变的情况下，每隔一张图像分析一次即可。

在这些横切的前ASIN动脉的相差显微图像中可以观察到低氧性肺血管收缩，该动脉与横切的支气管相邻。图像采集的时间点如图中圆圈所示，分别为：测量开始时、加入U 466 19后的测量结束时、在低氧气体环境中孵育30或40分钟后的即刻、用常氧气体环境缓冲液洗涤后，以及最终再次应用U 466 19之后。血管反应性以横切动脉管腔面积随时间的相对变化来记录。实验开始时的管腔面积定义为100%，血管收缩程度则以相对于初始面积的百分比值表示。

在此情况下，为更清晰地展示低氧反应，低氧暴露可使管腔面积减少60%。本实验中用于检测血管反应性的初始阶段未在此显示，设定暴露于低氧前即刻测得的值为100%。本研究中检测的另一类血管为位于肺泡隔连接处的肺泡间隔内动脉。在本组实验中，为实现该目的，分析了非选择性线粒体ATP敏感性钾通道开放剂sidal对小肺泡间隔内动脉低氧性肺血管收缩的影响。

将切片在低氧培养基中孵育。在无或含有50微摩尔西达露（sidal）的情况下，对照孵育在常氧气体培养基中进行，以便更清晰地展示对常氧、低氧或低氧加西达露的反应。在暴露于常氧或低氧气体培养基前即刻获得的数值设定为100%。暴露于西达露的动脉未显示面积减小，而未添加任何物质的低氧培养基中孵育的动脉则出现面积减小。

在常氧培养基中，管腔面积未检测到变化。本图展示了暴露于含或不含50微摩尔西达兰的小叶内ASIN小动脉在低氧气体培养基中的记录，数据表示为均值±标准误。该图显示了相对于低氧孵育开始时数值的相对数据。

未检测到血管反应性。在暴露于低氧气体的肺切片中，含有松果体的介质中由U 46619诱导的血管收缩不受该药物影响。观看本视频后，您应充分了解如何制备镜面精度的肺组织切片，以及如何利用这些切片对位于肺泡隔的直径在20至40微米之间的小肺内动脉，以及毗邻支气管和细支气管、直径在40至100微米之间的较大前肺动脉的血管反应性进行定量测量。