通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化 双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

本实验的总体目标是利用常规实验室设备，大量且高质量地制备人源巨噬细胞。首先，通过在Ficoll密度梯度液上离心血沉棕黄层中的血液，以获取外周血单个核细胞（PBMCs）；随后，再通过Percoll密度梯度离心，将单核细胞与淋巴细胞分离。

随后将单核细胞接种于特氟龙涂层的细胞培养袋中并进行分化。六至七天后，收集巨噬细胞并接种用于后续研究。所获得的细胞应表达成熟巨噬细胞的典型标志物，并能够对多种刺激产生反应，例如与肿瘤细胞共培养或经LPS刺激。与现有的对流离心、离心或磁珠激活细胞分选等方法相比，该技术的主要优势在于，仅需常规实验室设备即可生成人源巨噬细胞，无需昂贵的试剂或仪器。

尽管该方法易于操作，但初次使用者可能在密度梯度中难以观察和分离不同的细胞群体。因此，通过可视化演示这些步骤将有助于克服这些困难。本方案需进行双份操作，以便于平衡离心转子。

首先对两袋经离心分层血液所得的血沉棕黄层（buffy coat）组分进行消毒处理。然后将每袋血沉棕黄层转移至两个50毫升离心管中。另准备三个50毫升离心管，每管加入15毫升室温下密度为1.077克/毫升的FI call溶液。

现在缓慢而小心地将 30 至 35 毫升的富集层加到每根含有 FI call 的试管中。分层时应避免混合，随后在室温下以 400 ×g 离心半小时，期间两相之间不应发生扰动。离心后，在两相界面处将形成一层白色的外周血单个核细胞环。

使用塑料移液管去除这些层。将每位供体的三根试管中的层合并到两根50毫升的试管中，每位供体两管。通过加入1毫摩尔的P-B-S-E-D-T-A至40毫升刻度线处，洗涤收集的细胞，然后在室温下以300 ×g离心10分钟，离心时不要破坏细胞沉淀。

现在吸出并弃去上清液。然后重复洗涤，并用不含酚红的RPMI加FCS重悬细胞，将每位供体的细胞沉淀合并至20毫升不含酚红的RPMI加FCS中。此时每位供体应各有一管细胞。

现在配制第二密度梯度混合液：在50毫升离心管中，将23.13毫升室温的Per Coll溶液与1.87毫升10×PBS混合。每两个样品准备一管该混合液。接着，将23毫升该混合液转移至一个新的50毫升离心管中。

然后加入27毫升含酚红的RPMI加FCS。所得为46%ISO渗透压的细胞悬液。现在将每份供体的25毫升46%溶液转移至50毫升离心管中，并小心地将细胞混合液铺于其上层。

两个相层应通过颜色清晰可辨，且无间断。在室温下以550 ×g离心细胞30分钟。单核细胞将形成白色环状层，位于两相之间。用塑料移液管将这些细胞收集至50毫升离心管中。

用含有1毫摩尔P-B-S-E-D-T-A的溶液定容至50毫升，洗涤单核细胞。然后在室温下以400 ×g离心10分钟（不刹车），弃去上清液，并将沉淀的单核细胞重悬于20毫升培养基中。随后进入下一环节。

本方案使用FEP特氟龙涂层培养袋作为培养腔室。首先估算所收集单核细胞的数量。单核细胞体积较大，形态常不规则。

不要计数较小的淋巴细胞。如果某位供体可提供1亿至1.5亿个细胞，则准备180毫升添加补充物的RPMI培养基。如果细胞数量较少，则每3000万至5000万个细胞准备30毫升培养基。

在20毫升等分试样中，将细胞小心地混入180毫升已准备好的培养基中。然后使用连接在培养袋插头上的50毫升灌注注射器将含细胞的培养液装入培养袋。取下注射器，排出残留空气，并用锥形帽盖紧插头。

现在将袋子在5%二氧化碳条件下孵育6至7天。孵育6至7天后，将培养袋转移至冰上以收获细胞，将袋子完全浸入冰中，冷却1至3小时，使细胞充分脱落。接着，轻轻将袋子在边缘处拉伸约10次。

然后彻底消毒袋子的外部。将塞子替换为50毫升注射器。接着抽出细胞悬液，并转移至50毫升离心管中。

收集所有试管后，在室温下以 400 G 离心 10 分钟，然后吸去上清液，并将所有细胞重悬于 10 毫升 RPMI 加 FCS 中。随后按之前方法计数细胞。仅计数巨噬细胞，因为可能残留有淋巴细胞。

然后将细胞用于所需的应用，以重复使用培养袋。用70%乙醇洗涤两次，再加入50毫升70%乙醇，于室温下孵育过夜。次日，用无菌PBS冲洗培养袋三次。

然后用灭菌纸包裹并进行高压灭菌。一个袋子可轻松重复使用10次密度梯度离心。离心后可获得含有淋巴细胞和单核细胞的白色界面层。

在此我们观察第一个密度梯度。May Grunwald。这些细胞染色后显示出较高的核质比，这是淋巴细胞的典型特征，以及呈豆状或环状的细胞核，这是单核细胞的典型特征。

这些染色显示了第二梯度分离的结果。每个血沉棕黄层可获得约1.5亿个单核细胞，可进一步分化为约7000万个巨噬细胞。在20次制备中，47%的单核细胞转化为巨噬细胞。

可通过塑料表面贴壁进一步富集纯化的巨噬细胞，因为污染细胞不具备这一特性。接种后，大多数巨噬细胞呈现煎蛋样形态，而另一些则具有拉长的纺锤样表型。这些细胞的特征是表达多种标志物。

具有成熟巨噬细胞的典型特征。CD11b的表达以及缺乏CD209的表达均不支持树突状细胞的分化方向。分化完成后，这些细胞在功能和代谢上可保持活跃状态5至7天。

活细胞的钙染色显示了它们摄取来自肿瘤细胞的红色标记细胞外囊泡的能力。此外，巨噬细胞可以被激活，例如，用脂多糖刺激可诱导多种促炎基因的表达。通过该方法分离的巨噬细胞可进行多种功能检测，以回答有关健康和疾病状态下巨噬细胞生物学的基本问题。

观看本视频后，您应该能够充分了解如何大量生成人源巨噬细胞。但需要牢记的是，您所操作的人类血液样本可能具有潜在感染性。