在植入物表面极化并表征人单核细胞来源的M1与M2型巨噬细胞

本实验的主要目标是建立一套全面的方案，用于在不同植入材料表面培养巨噬细胞，并对其亚型进行表征。该表征过程采用了多种方法，包括定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），以测定基因表达谱、分泌蛋白及细胞表面标志物。结果表明，所建立的方案在诱导巨噬细胞极化、评估植入材料表面特性方面具有良好的实用性与有效性，并能够基于基因表达、分泌蛋白和细胞表面标志物对巨噬细胞进行准确鉴定。

此外，这些标志物呈现出稳定且特异的表达模式，可用于区分不同类型的巨噬细胞亚群。总体而言，该研究将有助于免疫调节材料的开发与设计，以改善和促进成功的组织再生过程，预防植入物相关的慢性炎症，并提高植入物的成功整合率。首先，将分离的人外周血单个核细胞重悬于15毫升预热的单核细胞贴壁培养基中，并转移至T-75细胞培养瓶中。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育90分钟，以促进贴壁。孵育结束后，弃去上清液，用预热的含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基轻轻倾斜冲洗细胞一次，以去除未贴壁或贴壁不牢的细胞。向贴壁细胞中加入15毫升完全培养基，其中含有10纳克/毫升巨噬细胞集落刺激因子。

孵育六天以促进分化。分化后，从培养瓶中移除培养基，并用10毫升PBS洗涤细胞5分钟。为使贴壁细胞脱落，加入10毫升预热的细胞解离液，孵育30分钟。

然后，轻轻敲击培养瓶以悬浮细胞，并将其转移至50毫升离心管中。为分离残留的细胞，向培养瓶中加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并刮取细胞。将刮下的细胞转移至同一50毫升离心管中。

将离心后的细胞悬液在300g条件下离心10分钟，弃去上清液，然后用5毫升预热的完全培养基重悬细胞。使用台盼蓝染色法，在血细胞计数板上对细胞进行计数，以确定细胞数量和活率。调整细胞数量，使每1毫升完全培养基中含有160,000个细胞，制备成细胞悬液。

接下来，将生物材料圆片在70%乙醇中进行超声清洗5分钟，随后在70%乙醇中灭菌30分钟。将钛圆片干燥后，放入未经处理的24孔板中，每孔加入1毫升制备好的细胞悬液。在37°C和5%二氧化碳条件下培养48小时，以获得M0型巨噬细胞。

为获得M1极化巨噬细胞，将干扰素γ和脂多糖加入24孔板的孔中。为进行M2极化，加入白细胞介素-4和白细胞介素-13。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时以诱导极化。

从人外周血单核细胞获得极化单核细胞来源的巨噬细胞后，将细胞上清液收集至1.5毫升离心管中。将钛片转移至新的24孔板中。以300g离心上清液5分钟，并将上清液转移至新离心管中。

根据制造商提供的具体说明，在450纳米波长下测定细胞因子和趋化因子。利用标准曲线计算分泌的细胞因子或趋化因子的浓度。使用二辛可宁酸蛋白检测试剂盒测定总蛋白量。

将分泌蛋白的浓度归一化为总蛋白的毫克数。用800微升PBS洗涤极化巨噬细胞两次。在室温下，将载片置于400微升固定液中孵育20分钟。

去除固定缓冲液后，用 400 µL PBS 将圆片洗涤三次。随后，加入 400 µL 封闭缓冲液，室温孵育 30 分钟，以封闭非特异性结合位点。弃去封闭缓冲液，将圆片与用 400 µL 染色缓冲液稀释的一抗溶液于室温孵育 1 小时。

孵育一小时后，移除一抗，用400 µL洗涤缓冲液将圆片洗涤三次。加入用染色缓冲液稀释的荧光标记二抗，于室温避光孵育一小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液将样品洗涤三次，每次三分钟。

加入含10毫摩尔DRAQ5的PBS，避光孵育15分钟。然后去除上清液，用PBS洗涤盖玻片一次。加入一滴封片介质，5分钟后盖上盖玻片，让样品干燥1小时。

干燥后，用透明指甲油密封边缘。为获得细胞的整体情况，使用共聚焦激光扫描显微镜在25倍放大倍数下对样品进行成像。将放大倍数调整至63倍，以确定表面标志物的结构和定位。

在钛表面成功将原代单核细胞来源的巨噬细胞极化为M1和M2型巨噬细胞，其中M1型巨噬细胞中CCR7表达更强，而M2型巨噬细胞中CD209表达更强。qRT-PCR分析显示，在钛表面和盖玻片表面，原代单核细胞来源的巨噬细胞均成功极化，M1型表现为CCR7和TNF-α的高表达，M2型表现为CD209和CCL13的高表达。高水平的炎症因子TNF-α和趋化因子CCL13在蛋白水平上进一步证实了M1和M2的极化状态。