检测基因组拷贝数变异的微阵列比较基因组杂交（Array CGH）技术

本实验的总体目标是通过阵列比较基因组杂交技术，检测基因组中可能导致多种遗传性疾病的失衡。该方法首先用荧光染料标记患者的DNA；在第二步中，将标记后的患者DNA与另一种带有不同荧光标记的参考DNA共同杂交至芯片上。

接下来，对芯片进行扫描，以测定患者和参考DNA结合到每个探针上的量。最后一步是对扫描图像进行处理，识别出患者DNA相较于参考DNA在基因组中拷贝数增多或减少的区域。最终通过芯片比较基因组杂交技术来确定患者是否携带导致遗传综合征的拷贝数变异。

该方法的可视化演示至关重要，因为阵列玻片的组装可能较为困难，且杂交过程中容易发生混合液溢出。在开始标记反应之前，将即用型96孔板中的核苷酸和引物在4摄氏度条件下避光解冻约一小时。

解冻后，将盖好的培养板在室温下再平衡30分钟，同时将DNA样品在60摄氏度下孵育15分钟以进行热平衡。在样品升温过程中，使用液体处理机器人向一个新的96孔板的每个孔中加入足量的无核酸酶水。当DNA样品准备就绪后，将每份样品各一微克转移至含有水的96孔板的对应孔中。

现在将20 µL的平衡核苷酸和引物分别转移至含有稀释DNA样本的各孔板中，并用条形封膜密封板孔，注意确保密封严密。接下来，在PCR仪中以99 °C对DNA进行10分钟的变性处理，PCR仪需配备加热盖；随后将板迅速置于冰上进行5分钟的骤冷处理，使引物退火。然后使用液体处理机器人向每个样本中加入10 µL的Clean-Exo DNA聚合酶。

用移液器混匀样品，然后密封微孔板并在37摄氏度下孵育16小时。次日，每孔加入5微升终止缓冲液以终止反应，随后去除未掺入的核苷酸。将每孔中的内容物转移至预先标记的2毫升离心管中。

将样品和DNA纯化离心柱以及相应的缓冲液加入离心柱处理机器人中。根据制造商的说明，离心柱处理机器人将向每管加入250 µL高盐DNA结合缓冲液，使标记的DNA结合到硅胶膜上，随后用500 µL洗涤缓冲液进行两次洗涤，每次500 µL，以去除膜上的杂质。然后，机器人将向膜中加入15 µL低盐洗脱缓冲液，以大约12 µL的体积洗脱纯化的标记DNA样品，用于后续杂交。

接下来，将杂交炉预热至 65 摄氏度，并预热背衬载玻片和杂交 chamber。配制杂交混合液时，加入 1.1 µL 的 cot-1 DNA、4.95 µL 厂家提供的封闭液以及 24.75 µL 杂交缓冲液。使用液体处理机器人将该混合液分配至新的 96 孔板的每一孔中，并在分配前对每个吸头进行预润湿，以提高转移的准确性。

接下来，用移液器加入9.35 µL适当标记的三端DNA，随后加入9.35 µL适当标记的五端DNA。每孔加样后密封反应板，在fourex仪器中孵育1分钟，并快速离心，使液体沉降至各孔底部。将标记的DNA在预杂交孵育器中进行变性处理。

首先在95摄氏度下孵育3分钟，随后在37摄氏度下孵育30分钟。然后在42摄氏度的加热平台上操作。将背板载玻片放入杂交 chamber 中，确保垫圈的透明部分与杂交 chamber 的窗口部分对齐，使用预润湿的吸头。

现在，将42微升杂交混合液缓慢地移液至阵列背板上相应位置的中心，注意液体不要接触到橡胶圈边界。待所有位置加样完毕后，小心地将阵列玻片缓缓放下，覆盖在背板玻片上，并组装杂交 chamber。

确保芯片阵列有文字的一面朝向背板，然后完全拧紧杂交室的螺丝，检查组装好的杂交室，确认杂交液未在橡胶圈边界外泄漏，且每个气泡高度约为4毫米。将杂交室垂直竖立放置时，旋转杂交室以进行检查。

每个位置的所有气泡都在移动。如果发现有气泡滞留不动，可轻轻敲击孵育室所在的实验台使其松动。随后将杂交孵育室放入65摄氏度的旋转烘箱中孵育24小时。

第二天，将杂交室浸入洗涤缓冲液一中，使用一对塑料平头镊子将载玻片分开。随后弃去垫片载玻片，将芯片载玻片放入盛有新鲜缓冲液一的染色架中并完全浸没。在约 700 毫升的洗涤缓冲液中洗涤芯片载玻片 1 至 5 分钟，同时使用微型磁力搅拌器剧烈搅拌。

然后将芯片载玻片转移至约 700 毫升的洗涤缓冲液中，共洗涤两次，每次 90 秒，第二次洗涤结束时需进行更剧烈的搅拌。轻轻将芯片载玻片从缓冲液中取出，应呈现干燥状态。

然后将芯片载玻片连同载片保护膜一起装入扫描仪的载片架中，随后对样品进行扫描。根据芯片制造商的说明，杂交后的芯片上每个探针均显示为红色和绿色荧光染料的混合信号。扫描仪及其配套软件会量化每个探针的红绿荧光信号比值，并根据其基因组位置将这些比值以 log₂ 比值的形式进行记录。

所得的芯片阵列图谱可用于解读被识别为基因组失衡的区域。例如，在这份来自一名威廉姆斯综合征患儿的图谱中，该综合征是一种由7号染色体近端区域低拷贝重复序列介导的复发性微缺失综合征，软件已用红线标示出该基因组失衡区域。正常基因组区域的对数荧光比值（prop fluorescent log ratio）应紧密聚集在零值附近，表明绿色与红色荧光信号的比值为1:1。

在此扫描中观察到的散在阵列信号，可能导致对异常区域的错误判读，或无法识别基因组失衡，其成因可能包括多种因素，如DNA质量较差、射线存在或大气中臭氧水平等。观看本视频后，您应能够充分理解如何处理患者样本以进行aCGH检测，并生成高质量的数据，用于后续分析及拷贝数变异的检测。