一种基于芯片的比较基因组杂交平台用于高效检测快中子诱变的Medicago truncatula突变体中的拷贝数变异

本基于芯片的比较基因组杂交实验方案的总体目标是快速鉴定由快中子轰击诱导的豆科植物截形苜蓿（Medicago truncatula）突变体中的拷贝数变异。该方法有助于回答豆科生物学领域的关键科学问题，例如，促进鉴定参与调控豆科植物根瘤发育的相关基因位点。

该技术的主要优势在于其具有极高的声誉和灵敏度，能够有效检测豆科植物截形苜蓿（Medicago truncatula）中中子轰击诱变体的拷贝数变异，例如缺失突变。本实验操作将由我本人以及遗传实验室的洪城 Wang 博士主持演示。取单株植物的幼嫩叶片组织一克，置于液氮中迅速冷冻。

然后，使用研钵和研杵在液氮中将冷冻的叶片组织研磨成细粉。使用DNA提取试剂盒从细粉中提取野生型和突变体基因组DNA样品。使用500 µL离心管，将每份野生型和突变体基因组DNA各1 µg用双蒸水稀释至终体积20 µL。

然后，向离心管中加入 5 µL 随机引物。快速涡旋混匀各管，短暂离心后立即放入热循环仪中，在 98 °C 下变性 DNA 样品 10 分钟。10 分钟后从热循环仪中取出离心管，立即置于冰水浴中放置 5 分钟。

然后，配制两种标记混合液，分别取25微升标记混合液一和标记混合液二，加入野生型和突变型DNA管中。用移液器将DNA与标记混合液吹打混匀三次，然后短暂离心。离心后，将各管置于PCR仪中，于37摄氏度孵育2小时，再于65摄氏度孵育20分钟，以灭活exo Klenow酶。

然后，加入 430 微升 One X TE 缓冲液，并混匀各管中的内容物。接着，短暂离心各管，将管中的溶液转移至带有 2 毫升收集管的纯化柱中。以 14,000 × g 离心纯化柱 10 分钟，并弃去滤过液。

向每个柱中加入 480 微升 One X TE 缓冲液，再次在 14,000 ×g 离心 10 分钟。弃去流出液。将每个野生型和突变标记的 DNA 从柱底部转移至新的离心管中。

用移液器测量每份标记DNA的体积后，用1× TE缓冲液将终体积调至80微升，然后用分光光度计测定标记DNA的浓度。接下来，取等体积的突变型和野生型DNA混合，用于在微阵列芯片上进行探针杂交以实现比较杂交。最后用1× TE缓冲液将终体积调至160微升。

接下来，配制杂交溶液，并用移液器吹打三次，充分混匀混合DNA中的三种试剂。短暂离心管子后，将其放入热循环仪中，在98摄氏度孵育10分钟，随后在37摄氏度孵育20分钟。请记住，在杂交前4小时将杂交炉预热至67摄氏度。

随后，将垫圈玻片放置于杂交室底部，在37摄氏度的PCR仪中孵育20分钟后，加入490 µL杂交溶液。为形成杂交室，用Medicago truncatula基因组微阵列芯片覆盖垫圈玻片，然后盖上杂交室并用夹具牢固固定。将组装好的杂交室置于杂交炉中，在67摄氏度下孵育40至48小时。

同时，准备两个装有250毫升室温洗涤缓冲液一的玻片洗涤皿。然后，制备一个装有37摄氏度洗涤缓冲液二的玻片洗涤皿。接着，准备一个装有70毫升乙腈的玻片洗涤瓶，以及另一个装有70毫升稳定与绘制溶液的玻片洗涤瓶。

将两个玻片清洗罐置于室温下的通风橱中。孵育结束后，从杂交炉中取出杂交室，松开室盖夹具以打开盖子。随后，取出密封垫片玻片中的微阵列芯片，并将其放入盛有洗涤缓冲液一的玻片清洗皿中。

将微阵列芯片从盖玻片上分离。接着，将微阵列芯片转移至含有洗涤缓冲液一的第二个玻片洗涤皿中。使用搅拌子，在室温下将溶液置于磁力搅拌器上轻轻搅拌五分钟。

将微阵列芯片置于盛有预热的洗涤缓冲液二的玻片洗涤皿中，用搅拌子在37摄氏度下搅拌洗涤1分钟。取出微阵列芯片，放入通风橱中含乙腈的玻片洗涤瓶内洗涤30秒。再将微阵列芯片转移至含有稳定与干燥溶液的玻片洗涤瓶中，再次洗涤30秒。

小心取出芯片，在通风橱内干燥一分钟。使用扫描仪以两微米分辨率扫描微阵列芯片。采用信号映射软件作为分析界面，分析突变型与野生型信号在八条染色体上的标准化log2比值分布情况。

对于推测的缺失，当 log₂ 比值小于或等于负 2.5 个标准差时，即被认定为有效。软件的分段分析显示，在染色体 4 上存在一个约 22 千碱基的缺失区域，如图所示。对微阵列探针所夹侧翼的缺失边界进行分析，显示其平均归一化 log₂ 比值降低。

该图还显示了另外六个带注释的基因，其中包括覆盖缺失区域的 son 基因。son 基因负责调控截形苜蓿（Medicago truncatula）的结瘤过程。接下来，通过 PCR 扩增确认缺失边界，结果显示从 FN6191 突变体中扩增出一个 1.5 kb 的产物，而在野生型中未扩增出该产物。

通过DNA测序确定了FN6191突变体中黑色箭头所示的缺失连接处。测序还确认了缺失区域边界的精确位置。一旦掌握该技术，若操作得当，可在72小时内完成。

为了获得高质量的数据，请务必在进行实验操作的房间内保持臭氧浓度处于较低水平。在完成该实验步骤后，还可进行其他检测，例如全基因组测序或聚合酶链式反应，以进一步回答有关基因组大小及拷贝数变异等问题。该技术的建立与验证为研究人员探索所诱导突变体中的拷贝数变异，以及在难以进行插入突变的植物物种（如Garden P.）中的自然变异提供了途径。切勿忽视，使用乙腈、稳定剂和干燥溶液时可能具有极高危险性。

采取预防措施至关重要，例如佩戴护目镜、避免与试剂直接接触，以及谨慎操作。